《Fisheries Science》：Seasonal dynamics of eukaryotic microalgae in Osaka Bay revealed from time series data by 18S rRNA amplicon sequencing analysis
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真核微藻全年对海洋初级生产具有基础性贡献。然而，对其在沿海生态系统中全年波动的全面了解仍然有限。在本研究中，研究人员通过分析18个月内每月采集的海水样本的18S rRNA基因扩增子测序数据，识别了大阪湾的主要微藻及其波动模式。真核群落结构包含超过3000个扩增
真核微藻全年对海洋初级生产具有基础性贡献。然而，对其在沿海生态系统中全年波动的全面了解仍然有限。在本研究中，研究人员通过分析18个月内每月采集的海水样本的18S rRNA基因扩增子测序数据，识别了大阪湾的主要微藻及其波动模式。真核群落结构包含超过3000个扩增子序列变体（ASVs），表现出清晰的季节动态。特别地，Picochlorum geojense（Trebouxiophyceae）是大阪湾的主要微藻，夏季相对丰度超过60%。P. geojense的最高相对丰度甚至高于大阪湾其他形成赤潮的物种：针胞藻纲的Heterosigma akashiwo和硅藻Skeletonema spp.。典范对应分析表明，温度和磷酸盐显著影响群落动态。此外，共现网络分析发现异养细菌Cryomorphaceae与P. geojense之间存在正相关，提示潜在的生源关联。类似地，主要硅藻和甲藻的ASVs被估计为高度连接的生态枢纽，因为它们与多个ASVs共现。这些结果表明，大阪湾优势微藻的季节动态与环境因素相关，并与特定原核生物表现出共现模式。
真核微藻和蓝细菌共同贡献了海洋净初级生产力的约50%，是海洋生物地球化学循环的重要驱动力。异养原核生物通过消耗微藻产生的有机质，将这些能量输入微食物环，进而影响整个海洋生态系统的物质循环。真核微藻并非一个单系类群，而是包括Archaeplastida、Ochrophyta、Dinoflagellata、Haptophyta和Cryptophyta等多个独立演化谱系的集合。已有研究表明，真核微生物群落具有显著的季节性波动，其动态不仅受光照、温度、营养盐等非生物因素的控制，还受共生、寄生和捕食等复杂生物互作的影响。然而，沿海生态系统中真核微藻全年尺度的完整动态及其与原核生物的关联仍缺乏深入理解。大阪湾是一个处于寡营养黑潮与河流输入交汇带的高生产力沿海生态系统，以往研究多集中于特定赤潮物种（如Heterosigma akashiwo和Skeletonema spp.），而对整个真核微生物群落的结构和季节演替缺乏系统认识。为此，研究人员利用连续18个月（2015年5月至2016年11月）的每月采样，通过18S rRNA基因扩增子测序，识别优势真核微藻、表征其季节动态，解析影响群落结构的环境因子，并基于共现模式探索真核与原核生物间的潜在关联。研究首次报道了Picochlorum geojense在大阪湾夏季形成高丰度（相对丰度最高达68.6%）的现象，其丰度甚至超过已知赤潮物种；同时发现水温和磷酸盐是驱动群落结构变化的主要环境因子，并揭示了一些优势微藻与特定细菌类群的共现关系。这些发现增进了对沿海真核微藻季节演替驱动机制和微生物互作网络的理解。
关键技术包括：①每月从大阪湾入口（日本大阪府，34°19′28″N, 135°7′15″E）5 m深度采集海水5 L，经3.0 μm聚碳酸酯膜过滤，对≥3.0 μm部分提取DNA，扩增18S rRNA基因V8–V9区并在MiSeq平台测序；②利用QIIME 2和DADA2进行质量控制、去噪和ASV聚类，基于PR2数据库（v5.1.0）进行物种注释；③采用Bray–Curtis相似性和主坐标分析（PCoA）评估β多样性，使用典范对应分析（CCA）检验环境因子与群落结构的关系；④采用FastSpar（SparCC算法实现）计算ASV间相关性并构建共现网络；⑤比较≥3.0 μm部分和<3.0 μm部分叶绿体16S rRNA基因ASV动态。样本队列来源为2015年5月至2016年11月大阪湾入口每月采集的海洋水样。
Overview of eukaryotic community in Osaka Bay：通过18S rRNA基因扩增子测序，共获得1,407,983条原始序列，质控后保留1,216,329条，聚类得到5127个ASVs。去除Opisthokonta后保留3710个ASVs，其中Alveolata相对丰度最高（38.6%），其次为Stramenopiles（27.9%）和Archaeplastida（14.9%）。稀疏曲线分析表明测序深度足以反映群落组成和动态。
Seasonal dynamics of microbial eukaryotes in Osaka Bay：基于Bray–Curtis相似性分析，随着两个样本之间时间间隔的增加，群落相似性先下降后回升，约12个月间隔时相似性约为0.3，表明真核微生物群落具有周期性年际波动。PCoA可视化也显示相同月份在不同年份的样本聚集在一起。
Dominant ASVs in Osaka Bay：定义在至少一个样本中相对丰度≥1%的ASV为优势ASV，共获得100个优势ASVs，占总reads的69.6%。优势ASVs主要属于甲藻和Mediophyceae（硅藻），也包含Chlorophyta（如Micromonas和Ostreococcus）。其中最丰富的ASV（eASV_1）被鉴定为Picochlorum geojense，占总reads的8.1%，夏季相对丰度超过60%，最高达到68.6%（2016年7月），高于同期其他赤潮物种（如Heterosigma akashiwo和Skeletonema spp.）。
Environmental factors shaping the dynamics of eukaryotic ASVs：典范对应分析（CCA）显示，水温（p=0.001）和磷酸盐（p=0.027）对真核群落动态有显著影响，硝酸盐可能也有贡献（p=0.054）；而盐度、硅酸盐、铵盐和亚硝酸盐的影响不显著（p>0.25）。
Co-occurrence network analysis between eukaryote and prokaryote ASVs：基于FastSpar的共现网络分析发现，P. geojense（eASV_1）与异养细菌Cryomorphaceae（ASV_60_1）呈正相关，并与Chloropicon roscoffensis（eASV_22）和Cyclotella striata（eASV_24）也呈正相关；而多种赤潮形成类型（如Skeletonema spp.、Thalassiosira spp.、Karlodinium spp.、Leptocylindrus danicus）具有较高的连接度（边数25–33），与Flavobacteriaceae、Rhodobacteraceae、SAR11和SAR86等多个细菌类群共现。
Comparison of dominant ASV dynamics between ≥ 3.0 μm and < 3.0 μm fractions：为验证微型真核藻在≥3.0 μm部分中的动态是否反映其真实丰度变化，研究人员将eASV动态与<3.0 μm部分的叶绿体16S rRNA基因ASV（plASVs）动态进行比较。结果显示，P. geojense（eASV_1）和Ostreococcus sp.（eASV_19）的动态分别与其对应属的plASVs显著相关（Pearson相关p<0.05，rho>0.5；FastSpar验证中Ostreococcus sp. ρ=0.754，P. geojense ρ=0.499），表明≥3.0 μm部分中微型真核藻的检出并非偶然，可反映实际种群动态。
在讨论部分，研究人员指出，Alveolata的相对丰度可能因甲藻具有较高的18S rRNA基因拷贝数而被高估。Bray–Curtis相似性显示，大阪湾真核微生物群落的年际波动（约0.3）比原核生物群落（约0.5）更为剧烈。P. geojense夏季高丰度在大阪湾是首次发现，提示Picochlorum属内不同物种存在显著的生态位分化。CCA结果与Nagai等（2019）研究部分一致，但氮、硅酸盐在本研究中未达到显著水平。共现模式提供了潜在的微生物互作候选，但需要实验验证。研究结论可翻译为：总之，研究人员通过2年的时间序列采样和18S rRNA基因扩增子测序，揭示了大阪湾真核微藻的动态。100个优势ASVs表现出周期性波动，表明每种真核藻类对沿岸碳循环具有季节特异性贡献。研究结果进一步表明，这些优势真核藻类的季节演替受确定性环境因子和生物相互作用的共同驱动，有助于加深对海洋生态系统复杂微生物网络的理解。
