《Human Cell》：Licoflavone B mitigates allergic rhinitis by restraining epithelial PI3K–AKT/NF-κB NLRP3 inflammasome signaling
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过敏性鼻炎（AR）仍具有很高的患病率，且现有治疗常不能完全控制病情；同时，越来越多的证据提示上皮PI3K–AKT/NF-κB介导的NLRP3炎症小体活化参与上气道炎症。本研究探讨甘草来源黄酮类化合物Licoflavone B（LFB）是否通过调控该信号轴缓解过
过敏性鼻炎（AR）仍具有很高的患病率，且现有治疗常不能完全控制病情；同时，越来越多的证据提示上皮PI3K–AKT/NF-κB介导的NLRP3炎症小体活化参与上气道炎症。本研究探讨甘草来源黄酮类化合物Licoflavone B（LFB）是否通过调控该信号轴缓解过敏性鼻炎。在卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠模型中，评估过敏性鼻炎样症状与鼻黏膜组织病理学改变，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量细胞因子水平，并通过免疫印迹法评估NLRP3炎症小体及PI3K–AKT/NF-κB信号的活化情况。开展无偏RNA测序并结合KEGG与GO富集分析，以识别潜在上游通路。通过体内使用IGF-1再激活PI3K–AKT、使用poly(I)刺激TLR3，以及在原代人鼻上皮细胞（HNEpCs）中，进一步探究PI3K–AKT/NF-κB信号的参与作用。同时进行分子对接，以探索LFB与PI3K之间潜在的相互作用。LFB减少喷嚏与鼻部搔抓，部分改善上皮增厚与炎症细胞浸润，并减少肥大细胞染色。LFB还降低IL-1β、IL-6、IL-5、IL-13与TNF-α水平，以及NLRP3炎症小体组分的表达。RNA测序分析将PI3K–AKT信号识别为主要富集通路之一，免疫印迹证实LFB降低PI3K、AKT与p65的磷酸化水平，而未明显改变其总蛋白水平。在HNEpCs中，IGF-1恢复通路磷酸化并部分重建细胞因子与炎症小体蛋白表达，从而减弱LFB的作用。同样，IGF-1或poly(I)在体内部分削弱LFB诱导的症状与组织学改善。分子对接将LFB定位于PI3K催化口袋内，为潜在的LFB–PI3K相互作用提供结构合理性。总体而言，这些发现表明LFB缓解OVA诱导的过敏性鼻炎样炎症，并与鼻组织、HNEpCs及受刺激肥大细胞模型中PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3信号轴活化降低相关。IGF-1或poly(I)对这些作用的部分逆转进一步支持该信号通路的参与。
研究背景方面，过敏性鼻炎（AR）是常见的上气道免疫介导性疾病，损害生活质量与工作效率，全球患病率约为10–30%，且存在诊断与治疗不足。现有治疗包括鼻内糖皮质激素、口服抗组胺药、白三烯拮抗剂及过敏原免疫治疗，虽可控制多数患者症状，但受限于应答不完全、依从性问题与复发，且不直接靶向目前被认为参与气道疾病的炎症小体中心机制。越来越多证据表明NLRP3炎症小体参与2型偏向上气道炎症与黏膜重塑，使其成为治疗节点；在NLRP3上游，上皮与髓系PI3K–AKT–NF-κB信号整合过敏原与病毒模拟信号以放大细胞因子产生，气道上皮PI3K活性可驱动NLRP3依赖性炎症，poly(I:C)刺激NF-κB可强烈诱导与鼻炎病理相关的上皮细胞因子。天然产物来源小分子因结构多样性、多靶点活性与较好安全性受到关注，甘草等药用植物来源黄酮在多种炎症模型中显示广泛抗炎与免疫调节作用，但特定黄酮单体对过敏性鼻炎的作用，尤其在炎症小体相关信号通路与上皮–肥大细胞炎症网络背景下，仍认识不足。Licoflavone B（LFB）是甘草来源天然黄酮，已有报道具有抗炎与免疫调节潜力，但其能否调控过敏性气道炎症及相关信号机制尚未被系统研究。基于PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3轴在AR发病中的新兴作用及黄酮介导免疫调控的研究兴趣，研究人员提出LFB可能通过抑制炎症小体相关炎症信号减轻过敏性鼻炎的假设。
研究人员开展了卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠过敏性鼻炎模型研究，结合行为学与组织病理学评价、细胞因子与趋化因子谱分析、炎症小体分析、通路再激活实验及分子对接方法，重点确定LFB的抗炎作用是否与鼻上皮细胞与肥大细胞中PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3信号级联的调控相关。研究得出，LFB缓解OVA诱导的过敏性鼻炎样炎症，并与鼻组织、HNEpCs及受刺激肥大细胞模型中PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3信号轴活化降低相关；IGF-1或poly(I)对这些作用的部分逆转进一步支持该信号通路的参与。其重要意义在于，概念上将一种明确的甘草黄酮定位于PI3K–AKT/NF-κB位于NLRP3上游的机制级联中，把上皮信号与黏膜炎症及症状联系起来；实践上，IGF-1或poly(I:C)对LFB作用的反转为植物化学物研究中常缺失的通路依赖性提供证据，为后续药物化学或联合策略细化靶点空间。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用OVA诱导BALB/c小鼠过敏性鼻炎模型并进行行为学评分与鼻黏膜H&E及甲苯胺蓝染色；ELISA定量鼻黏膜细胞因子与趋化因子；免疫印迹检测NLRP3炎症小体及PI3K–AKT/NF-κB磷酸化；对鼻黏膜行无偏RNA测序及KEGG、GO富集分析；在原代人鼻上皮细胞（HNEpCs，ATCC）与RBL-2H3大鼠嗜碱性白血病细胞（肥大细胞模型，Cmbio）中进行体外刺激、LFB处理及IGF-1通路挽救实验，并以CCK-8检测细胞活力；体内以IGF-1或poly(I:C)进行通路或固有免疫再激活；采用AutoDock Vina进行分子对接。
研究结果方面，LFB减少AR样行为与鼻黏膜组织病理：与对照相比，AR小鼠喷嚏与鼻部搔抓增加，LFB显著降低两项行为学指标；H&E显示AR黏膜上皮增生、水肿与密集炎症细胞浸润，LFB部分恢复上皮结构并减少炎症浸润；甲苯胺蓝染色显示AR中肥大细胞明显增多，LFB使其减少。LFB通过抑制NLRP3炎症小体减轻气道炎症：AR组IL-1β、IL-6、IL-5、IL-13与TNF-α显著升高，LFB显著降低各细胞因子；AR鼻组织中CCL2与CXCL12明显升高，LFB显著降低两者；免疫印迹显示AR鼻组织NLRP3、ASC、caspase?1与IL-1β上调，LFB降低这些炎症小体组分丰度。LFB重塑AR转录组并限制PI3K–AKT/NF-κB轴：RNA-seq显示AR存在广泛转录改变并被LFB逆转，KEGG分析中PI3K–AKT通路居前，GO分析涉及白细胞活化、细胞因子产生与细胞外基质组织；免疫印迹显示AR组织PI3K、AKT与p65磷酸化升高，LFB处理后明显降低，而总PI3K/AKT水平基本不变。PI3K–AKT再激活部分减弱LFB对HNEpCs与肥大细胞细胞因子及NLRP3炎症小体活化的抑制：HNEpCs呈典型鹅卵石形态，LFB不降低细胞活力；在刺激的HNEpCs中，LFB降低PI3K、AKT与p65磷酸化，IGF-1使通路再激活至模型水平；LFB降低IL-1β、IL-6、IL-5、IL-13、TNF-α及CCL2、CXCL12，IGF-1部分逆转这些降低；LFB减少NLRP3、ASC、caspase?1与IL-1β，IGF-1恢复其丰度。在活化肥大细胞中，LFB显著降低升高的IL-1β、IL-5、IL-6、IL-13与TNF-α，IGF-1部分逆转；LFB抑制NLRP3炎症小体相关蛋白及PI3K、AKT、NF-κB p65磷酸化，IGF-1部分恢复通路活化。IGF-1或poly(I)部分削弱LFB诱导的症状与组织学改善：LFB显著减少喷嚏与鼻部搔抓，改善黏膜结构并减少肥大细胞积聚；IGF-1再激活PI3K–AKT或poly(I:C)再刺激炎症后，症状评分增加、上皮增厚与肥大细胞浸润恢复至接近AR水平；磷酸化PI3K、AKT与p65在AR中升高、LFB抑制、IGF-1或poly(I:C)再升高，总PI3K/AKT基本不变。LFB相关的细胞因子输出与NLRP3活化降低被IGF-1或poly(I)部分减弱：LFB降低IL-1β、IL-6、IL-5、IL-13、TNF-α及CCL2、CXCL12，并减少NLRP3、ASC、caspase?1与IL-1β；IGF-1或poly(I:C)部分恢复细胞因子产生与炎症小体蛋白；分子对接将LFB置于PI3K催化口袋并形成稳定预测接触，但该计算机结果应视为假设生成而非LFB直接抑制PI3K的确切证据。
讨论部分总结：本研究主要发现是LFB缓解OVA诱导的过敏性鼻炎样表型，并与鼻组织炎症细胞因子产生减少、肥大细胞染色减少及NLRP3炎症小体相关蛋白抑制相关；这些观察与炎症小体相关细胞因子信号参与气道炎症及黏膜免疫反应的公认作用一致。机制上，实验证据主要支持上皮与肥大细胞相关PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3信号的参与；在HNEpCs与刺激的RBL-2H3肥大细胞中，LFB降低PI3K–AKT/NF-κB活化与炎症介质产生，IGF-1部分逆转这些作用；但本研究未直接检测巨噬细胞极化与嗜酸性粒细胞反应，因此现有数据不能确定LFB是否在体内直接调控巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或其他免疫细胞群体。介质水平上，LFB降低IL-1β、IL-6、IL-5、IL-13、TNF-α、CCL2与CXCL12，并减少鼻组织NLRP3、ASC、caspase?1与IL-1β丰度；转录组分析将PI3K–AKT列为富集通路，免疫印迹显示LFB处理后PI3K、AKT与p65磷酸化降低而总PI3K与AKT基本不变；这些发现支持PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3信号参与LFB抗炎作用，但未确立LFB直接抑制PI3K。研究还指出，除所检测的上皮PI3K–AKT/NF-κB通路外，溶血磷脂相关信号与LPA受体通路可能是上游调控网络，但本研究未直接测定溶血磷脂种类、LPA受体、巨噬细胞极化与嗜酸性粒细胞反应，故应视为未来研究方向而非本发现的解释机制。分子对接提示LFB可能适配PI3K催化口袋，但对接具有预测性，不能证明直接靶点结合或酶抑制，需生化激酶实验、生物物理结合研究、细胞热位移实验或pull-down实验验证。综上，研究结论为：LFB缓解OVA诱导的过敏性鼻炎样炎症，并与鼻组织、HNEpCs及受刺激肥大细胞模型中PI3K–AKT/NF-κB/NLRP3信号轴活化降低相关；IGF-1或poly(I)对这些作用的部分逆转进一步支持该信号通路的参与。
