咖啡暴露改变Caco-2细胞中5-羟色胺转运体表达及DNA甲基化

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》：Serotonin transporter expression and DNA methylation are altered by coffee exposure in Caco-2 cells

咖啡消费与结直肠癌（CRC）风险降低相关，但其潜在机制尚未完全阐明。肠道5-羟色胺（5-HT）在CRC发生发展中发挥复杂作用。肠上皮细胞中的5-羟色胺转运体（SERT）调控肠道5-HT水平。近期证据提示SERT表达与SLC6A4（SERT基因）启动子区功能性CpG位点（CpG3）的DNA甲基化之间存在相关性。本研究以肠上皮细胞模型Caco-2细胞为对象，探讨咖啡对SERT表达的影响。将Caco-2细胞暴露于1–10%（v/v）速溶咖啡溶液48 h，发现SERT介导的5-HT摄取及SERT mRNA表达呈浓度依赖性下降。该效应在不同速溶咖啡品牌及咖啡豆品种中均可观察到，但暴露于咖啡主要成分（如咖啡因和绿原酸）或未烘焙生咖啡豆提取物未能重现该效应。焦磷酸测序显示咖啡暴露改变了CpG3的DNA甲基化。该初步研究提示咖啡预防CRC的一种新机制：通过SLC6A4的表观遗传修饰抑制肠上皮细胞中SERT的表达。

研究背景方面，5-羟色胺（5-HT）是一种由色氨酸（Trp）合成的神经递质，在中枢和外周神经系统中发挥多种作用。5-HT的合成由两种限速酶介导，即色氨酸羟化酶（TPH）1和TPH2。TPH2调控中枢和肠神经系统神经元中的5-HT合成，而TPH1负责肠黏膜中肠嗜铬（EC）细胞产生5-HT。细胞对5-HT的摄取主要由Na?/Cl?依赖性5-羟色胺转运体（SERT）介导，SERT表达于肠上皮细胞和血小板中。肠上皮细胞中的SERT被认为是肠道组织中5-HT浓度的关键调节因子，因为细胞内5-HT被单胺氧化酶（MAO）灭活。结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，其发病率和死亡率预计将增加，尤其在发展中国家，因此理解其发病机制至关重要。肠道5-HT在CRC发展中具有双重且相反的作用。一项开创性研究利用肠上皮细胞特异性敲除TPH1的小鼠模型证明，5-HT保护肠道干细胞免受DNA损伤和早期肿瘤发生，但促进已形成肿瘤的生长。这一发现提示调节肠道SERT表达或活性可能影响CRC的预防和进展。SERT由位于染色体17（17q11-17q12）的SLC6A4基因编码。两种机制与SLC6A4表达调控有关：启动子区的功能性多态性，即5-羟色胺转运体连锁多态性区域（5-HTTLPR），以及SLC6A4启动子附近CpG位点的甲基化。5-HTTLPR包含20–23 bp高度同源序列的14或16次重复，分别称为短（S）和长（L）等位基因。S等位基因通常与转录活性降低相关。此外，Sugawara等（2011）和Ikegame等（2020）在SLC6A4启动子CpG岛岸上鉴定了一个功能性CpG位点（chr17:30,235,246-30,235,247），并报道该位点的DNA甲基化抑制转录活性。然而，这些机制的大多数研究集中于精神疾病，其与CRC的相关性在很大程度上仍不清楚。多种环境因素，包括饮食和生活方式，参与CRC的发生和预防。咖啡是其中一种被广泛研究的因素，因为它是全球消费量最大的饮料之一。多项研究表明咖啡消费与CRC风险降低相关，可能通过非咖啡因依赖机制。2011年一项对15项前瞻性研究的荟萃分析表明，高咖啡消费量与不消费或低消费相比与CRC风险降低相关。报道这种保护作用的研究通常将其与每天约≥4杯的消费量联系起来。咖啡消费与健康的关系不仅限于CRC。咖啡消费与多种疾病死亡率之间的J形关系已被 consistently 观察到。尽管有这些流行病学发现，关于CRC的证据仍不确定，潜在机制也知之甚少。值得注意的是，咖啡的全身性和CRC特异性有益效应广泛归因于咖啡因以外的成分。咖啡含有两大类生物活性化合物：酚类化合物（主要是绿原酸（CGA））和生物碱（如咖啡因和葫芦巴碱）。这些酚类抗氧化剂的谱系不仅受烘焙显著影响，还受各种加工方法影响。此外，咖啡类黑精具有高抗氧化活性，可能在烘焙过程中掺入CGA衍生物。近期研究开始探索这些成分的分子影响，揭示其参与芳香烃受体（AhR）的激活，并提示其可能发挥全局DNA甲基化抑制效应，同时诱导位点特异性DNA甲基化变化。鉴于胃肠道腔每日约分泌和吸收8 L液体，假设每天消费≥4杯咖啡（每杯估计227 mL，标准咖啡杯），可以推断肠上皮细胞在肠腔液体中暴露于平均浓度超过10%的咖啡。然而，有机化合物在咖啡消费生理反应中的具体作用仍不清楚。因此，需要进一步研究以阐明导致观察到的CRC风险降低的通路。研究人员假设咖啡可能部分通过降低肠上皮细胞中SERT表达，从而增加肠道中5-HT可用性来降低CRC风险。本研究使用表达SERT的模型肠上皮细胞系Caco-2细胞研究咖啡对SERT表达的影响。研究人员报道咖啡暴露抑制SERT表达，且该效应伴随CpG3甲基化的改变。

研究人员开展的研究方面，本研究使用Caco-2细胞（人结肠腺癌细胞系，来源于Riken Cell Bank， passages 61–76）作为肠上皮细胞模型。细胞在MEMα培养基（含10% FBS和1% P/S）中培养，传代时按Natoli等（2011）方法在50%汇合度时传代，以最小化自发分化的影响。实验时，细胞以0.2×10? cells/cm2密度接种于24孔板或60 mm培养皿，培养约3天至汇合，再继续培养7天促进自发分化为肠上皮样细胞，随后进行2天药物处理，用于5-HT摄取实验和RT-PCR等分析。5-HT摄取实验使用新鲜配制的KRH缓冲液（含100 μM帕吉林、100 μM L-抗坏血酸和100 nM [3H]5-HT），非特异性摄取用含10 μM氟伏沙明的KRH缓冲液测定。Caco-2细胞在24孔板中培养10天（汇合后7天）用于实验，37°C孵育15分钟，洗涤后加入RIPA缓冲液裂解，用液体闪烁计数器定量放射性，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度，放射性以蛋白浓度归一化计算[3H]5-HT摄取。qRT-PCR方面，用RNeasy Mini Kit提取总RNA，QuantiTect Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，使用TaqMan FAM标记的MGB引物探针组（Hs00984349_m1）定量SLC6A4 mRNA表达，GAPDH作为参照基因，用2^?ΔΔCT方法计算相对表达量。DNA甲基化分析方面，用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit提取基因组DNA，EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit进行亚硫酸氢盐转化，随后对SLC6A4 CpG岛岸（chr17:30,235,139-30,235,342 in GRCh38/hg38）进行亚硫酸氢盐PCR扩增，引物为正向5′-TTTTAGTTGTTTGGTATTTGTGTTA-3′和反向（5′生物素化）5′-AAAACTTTACAACCTCTTAAAAACCC-3′。PCR产物用PyroMark Q96 Vacuum Workstation制备，使用测序引物5′-AATATAAATTATGGTTGAA-3′，在PSQ 96MA系统上进行焦磷酸测序，测定SLC6A4 CpG岛岸内两个CpG位点（CpG3: chr17:30,235,246-30,235,247和CpG4: chr17:30,235,271-30,235,272; GRCh38/hg38）的DNA甲基化水平。速溶咖啡样品信息见表1（原文），咖啡制备为将速溶咖啡直接溶于室温缓冲溶液，按制造商说明将2 g速溶咖啡与140 mL KRH缓冲液混合，1000 rpm离心1分钟后取上清作为100%浓缩咖啡（100% v/v），处理细胞时加入培养基达到适当浓度，对照加入KRH缓冲液。生咖啡豆和烘焙咖啡豆样品方面，绿（未烘焙）巴西桑托斯No.2咖啡豆（Arabica品种混合，生长于Terra Rossa土壤）由Nishinaya Coffee Corporation（广岛，日本）捐赠，用TORNADO KING烘焙机烘焙至浅烘焙（Light）和意大利烘焙（Italian）两种程度，生豆和两种烘焙豆均用手动磨研磨，然后用95°C蒸馏水在法压壶（Bodum, Inc.）中按制造商说明冲泡，提取物在?80°C冷冻保存，实验前即时解冻。细胞系认证方面，Caco-2细胞购自Riken Cell Bank（2020年12月9日），2026年4月重启培养并进行STR分析（GenePrint10 System, Promega），结果与对照Caco-2（CVCL_0025）完全一致，支原体检测（实时PCR）阴性。

研究结果方面，Caco-2细胞中SERT的表达：用qRT-PCR测定60 mm培养皿中培养的Caco-2细胞的SERT mRNA表达，显示Caco-2细胞表达SERT，SERT表达随传代次数变化（Supplemental Fig. 2）。咖啡对SERT摄取活性的影响：为研究咖啡对SERT活性的影响，将Caco-2细胞暴露于不同浓度速溶咖啡溶液48小时。常规咖啡（NESCAFé Gold Blend）和低因咖啡（NESCAFé Gold Blend Decaffeinated）均浓度依赖性降低SERT摄取活性（Fig. 2A）。全球咖啡主要来源于两个物种：Coffea arabica L.和Coffea canephora var. robusta。用仅由各物种豆制成的速溶咖啡实验，Arabica来源和Robusta来源速溶咖啡在10%浓度处理Caco-2细胞48小时，均显著降低SERT摄取活性（Fig. 2B左）。为评估可重复性，测试了不同制造商的速溶咖啡样品，所有测试的速溶咖啡均显示SERT摄取活性降低（Fig. 2B右）。对咖啡调控SERT摄取的机制进行了研究。在Caco-2细胞中，cAMP/PKA通路通过SERT磷酸化降低SERT摄取。为检验cAMP/PKA通路的参与，使用PKA抑制剂（KT5720, 1 μM），PKA抑制不影响咖啡诱导的SERT摄取降低（Fig. 2C）。咖啡是弱酸性、低渗溶液，溶于PBS（pH 7.4）后pH约6，渗透压50 mOsm/L。为检验酸度和渗透压的影响，测试了用HCl调至pH 6的PBS和含50 mM甘露醇的培养基，酸度和渗透压均不影响SERT摄取活性（Supplemental Fig. 3）。咖啡对SERT mRNA表达的影响：由于咖啡降低SERT摄取活性，研究人员假设咖啡也可能影响SERT表达水平。测定Caco-2细胞暴露于不同浓度速溶咖啡溶液48小时后的SERT mRNA表达，常规和低因咖啡均浓度依赖性降低SERT表达（Fig. 3A）。不同品种速溶咖啡中也观察到SERT mRNA表达降低（Fig. 3B），与SERT摄取活性降低一致。此外，研究了短期（6小时）咖啡暴露对SERT mRNA表达的影响，短期暴露显著降低SERT mRNA表达（Fig. 4A）。为评估咖啡诱导的SERT表达变化的可逆性，将Caco-2细胞暴露于咖啡48小时，用PBS洗涤两次后在新鲜MEMα中培养，每24小时测定SERT mRNA表达水平，SERT表达在咖啡洗脱后24小时内恢复至对照水平（Fig. 4B）。这些结果提示咖啡对SERT mRNA表达的影响发生相对较早，且由于可逆的转录调控。咖啡烘焙和成分对SERT mRNA表达的作用：由于咖啡组成随烘焙变化，研究了生咖啡豆和烘焙咖啡豆（浅烘焙和意大利烘焙）提取物对SERT mRNA表达的影响，仅烘焙咖啡豆提取物降低SERT表达（Fig. 5A）。此外，使用文献报道的适当浓度测试了咖啡主要成分对SERT mRNA表达的影响，咖啡因（1或5 mM）（Fig. 5B）、绿原酸及其降解产物、葫芦巴碱及其降解产物均不影响SERT mRNA表达（Fig. 5C）。这些结果提示咖啡对SERT mRNA表达的影响不是由于咖啡因或其他已知咖啡成分，而是由于烘焙过程中产生的物质。与咖啡诱导的SERT mRNA降低相关的信号通路和表观遗传修饰：关于调控SERT表达的信号通路知之甚少。在Caco-2和肠上皮细胞中，p38 MAPK通路可能参与SERT表达降低。已知咖啡成分是芳香烃受体（AhR）的配体，SERT活性与AhR通路之间存在功能性关联。为检验p38 MAPK和AhR通路的参与，使用p38 MAPK抑制剂（SB203580, 20 μM）和AhR抑制剂（SR-1, 1 μM），p38 MAPK和AhR抑制均不影响SERT mRNA表达（Fig. 6A和B）。由于SERT表达与精神疾病相关，研究人员假设表观遗传修饰如DNA甲基化可能参与咖啡诱导的SERT表达变化。既往研究在SLC6A4 CpG岛岸上鉴定了功能性甲基化位点（CpG3和CpG4），与双相障碍和SERT表达降低相关（Fig. 7A）。精神分裂症中也观察到CpG3高甲基化，提示CpG3甲基化在SERT表达调控中的作用。为研究咖啡对SLC6A4甲基化的影响，将Caco-2细胞暴露于低因咖啡48小时，提取基因组DNA，亚硫酸氢盐转化，焦磷酸测序测定CpG3和CpG4甲基化率。咖啡暴露显著增加CpG3甲基化3.7%（低因咖啡），常规咖啡显示CpG3甲基化增加2.8%的趋势（Fig. 7B左）。咖啡暴露不影响CpG4甲基化（Fig. 7B右）。

讨论部分总结：据研究人员所知，本研究首次提供证据表明咖啡暴露在人肠上皮细胞模型中诱导SLC6A4 mRNA表达的浓度依赖性抑制（Fig. 3A）及相关的5-HT摄取活性降低（Fig. 2A）。关键的是，这种转录抑制被证明与SLC6A4基因CpG岛岸上特定CpG位点（CpG3）DNA甲基化的显著增加相关（Fig. 7B）。这种SERT抑制代表一种高度稳健的现象，而非单一咖啡制备的伪影。该效应在不同品牌速溶咖啡、主要咖啡物种Coffea arabica和Coffea robusta、以及含咖啡因和低因咖啡中一致观察到（Figs. 2A, B, 3A, B）。值得注意的是，低因咖啡表现出与含咖啡因咖啡相当的效应，强烈表明咖啡因不是观察到的主要致病因素。总体而言，这些观察表明负责抑制SERT表达的生物活性物质是烘焙咖啡豆中普遍存在的成分，而非特定于某一品种或品牌。研究结果强烈提示负责SERT抑制的活性成分不是生咖啡豆中原本存在的主要成分，而是烘焙热加工过程中产生或释放的物质。首先，咖啡中最常见的生物活性成分基于阴性数据被排除。咖啡因（高达5 mM）不影响SERT mRNA表达（Fig. 5B）。同样，5-CQA（生豆中丰富的主要多酚）及其主要降解产物咖啡酸和奎尼酸未能抑制SERT表达（Fig. 5C）。此外，另一种主要生物碱葫芦巴碱及其主要代谢物烟酸也无活性（Fig. 5C）。尽管这些化合物因与咖啡健康益处相关而被广泛研究，但研究结果表明它们不直接参与此处观察到的SERT抑制特定现象。实验仅证明主要咖啡成分单独测试时均不影响5-羟色胺转运体mRNA水平。咖啡成分间的多组分协同是否影响5-羟色胺转运体表达仍是未来研究的主题。本研究最有力的证据之一是烘焙和未烘焙生豆提取物效应的鲜明对比。仅浅烘焙和意大利烘焙豆制备的提取物显著抑制SERT mRNA表达，而生豆提取物无此效应（Fig. 5A）。这一结果明确表明生物活性化合物在咖啡豆热加工过程中产生。例如，具有高抗氧化活性的咖啡类黑精是烘焙过程中形成的5-CQA降解产物。因此，抑制SERT表达的活性成分极可能存在于这些烘焙产物中，值得进一步研究。咖啡诱导的表观遗传修饰方面，本研究表明咖啡暴露特异性增加CpG3位点甲基化水平约3–4%，而对CpG4位点无影响（Fig. 7B）。尽管这一绝对变化看似微小，但其生物学意义可能重大。CpG3位点位于称为“CpG岛岸”的区域，邻近常规CpG岛。近期表观基因组研究揭示，与基因表达强烈相关的组织特异性或疾病相关甲基化变化常发生在这些岸区域而非CpG岛本身。含CpG3的序列在灵长类中高度保守，提示其在体内是重要调控区域。确实，既往研究中的报告基因实验证明仅在CpG3引入甲基化显著消除SLC6A4启动子活性。此外，CpG3是男性双相障碍和精神分裂症患者中唯一确认持续显著高甲基化的位点。因此，对CpG3而非CpG4效应的特异性提示该现象可能是靶向调控事件而非非特异性全基因组甲基化变化。咖啡成分可能诱导位点特异性DNA甲基化变化并表现对DNA甲基化的普遍抑制效应。有研究提示某些多酚可能通过增加DNA甲基转移酶结合诱导启动子和增强子区域高甲基化来抑制癌基因转录。研究人员此前报道存在 putative 结合位点与含CpG3序列重叠的转录因子。本研究的另一关键发现是SERT抑制的快速可逆性。咖啡暴露6小时后观察到SERT mRNA显著降低（Fig. 4A），从培养基中去除咖啡（洗脱）后，表达水平在24小时内恢复至基线（Fig. 4B）。尽管CpG3高甲基化及其相关转录抑制的确切机制尚待阐明，但这些结果表明该转录抑制发生迅速且可能可逆。短期咖啡暴露期间的DNA甲基化变化尚未验证，然而，通过恐惧条件反射和物理刺激已在体内确认数小时内发生的DNA甲基化改变。咖啡是否诱导类似的即时变化仍有待确定。考虑到多种表观遗传调控机制间的相互作用，进一步研究对于阐明SERT mRNA转录抑制与CpG3高甲基化之间的因果关系至关重要。5-HTTLPR与转录水平的关系方面，Caco-2细胞中的5-HTTLPR为LA/LA，鉴于其来源于白人供体，这并不意外。该遗传多态性影响肠道SERT表达的程度仍不清楚。SLC6A4的DNA甲基化是5-HTTLPR基因型依赖性的，携带S等位基因的样本可能产生不同结果。然而，对SERT启动子区的开创性详细检查提示调控肠上皮SERT转录的特定启动子区域与5-HTTLPR之间可能存在功能关联缺失。本研究关注的CpG3位于外显子1A下游的CpG岛岸上。CpG3高甲基化与任一启动子区域间的强相关性仍是未来研究的主题。局限性方面，本研究存在若干局限性。首先，本研究是仅报道体外实验结果的基礎研究。需要额外研究确定咖啡的SERT表达抑制效应能否在活生物体中重现。考虑到解剖和生理条件，需要进一步验证观察到的SERT表达降低是否在体内发生。如上所述，口服摄入的液体在短暂接触上消化道上皮细胞后在小肠中停留数小时。咖啡的单个成分在胃肠道不同区域被吸收和代谢。咖啡因在小肠吸收，而70%的绿原酸到达大肠；因此，结肠被认为是多酚和类黑精等化合物代谢物的主要作用部位。这些解剖部位上皮细胞暴露于咖啡的程度和持续时间，特别是在过量咖啡摄入条件下，是未来研究的问题。研究人员尝试使用多种抗体通过免疫染色和Western blotting分析证明SERT蛋白的定位及其咖啡暴露后的降低。不幸的是，未能获得足够信号评估变化。怀疑多种因素，包括内源性蛋白表达水平、抗体可靠性和实验伪影。使用来源于结肠腺癌的Caco-2细胞时，必须记住其转录谱与正常细胞不同。此外，传代次数、传代次数和培养条件等因素显著影响Caco-2细胞性能。必须认识到Caco-2细胞表现出小肠上皮细胞（肠上皮细胞）和大肠上皮细胞（结肠细胞）的表型。尽管T84细胞被认为是结肠上皮的优良模型，但本研究选择Caco-2细胞特别是因为其稳定表达SERT。此外，本研究关注的CpG3位点在啮齿类动物中不存在；因此，必须使用人源细胞进行实验。本研究未鉴定参与SERT转录抑制的成分。这是由于咖啡中成分数量众多。尽管如此，数据提供了一些见解。常规和低因咖啡中SERT表达均降低，但仅咖啡因未能重现该现象。由于在不同饮料制造商销售的速溶咖啡、Arabica和Robusta豆制成的速溶咖啡以及烘焙咖啡豆制成的咖啡中均观察到可重复性，预期涉及咖啡共有的普遍成分。烘焙导致的反应增加提示生咖啡成分降解产物或新生成物质的影响。

研究结论部分翻译：本研究证明咖啡调节Caco-2肠上皮细胞模型中的SERT表达。基于这些分子变化，研究人员假设咖啡可能影响细胞内外5-HT活性。虽然推测这种SERT依赖机制可能与报道的咖啡对CRC的预防效应相关是诱人的，但当前发现仅限于单一细胞系，未直接评估CRC相关表型。需要进一步的体外和体内研究，纳入功能实验（如细胞增殖和凋亡），以证实所提出的机制。