他克莫司结膜下注射的兔眼安全性评估

《BMC Ophthalmology》：Ocular safety of subconjunctival injection of tacrolimus in rabbits

　　

专业摘要翻译： 目的：本研究的主要目的是评估他克莫司（tacrolimus）在兔眼结膜下注射的安全性。 方法：研究纳入10只新西兰白兔。制备浓度为0.03%的他克莫司用于结膜下注射。将注射用水加入1000 μg他克莫司胶囊（Prograf；Astellas Pharma Inc.，东京，日本）中配制0.03%浓度。Prograf胶囊核心中的非活性成分（赋形剂）包括羟丙甲纤维素（hypromellose）、交联羧甲纤维素钠（croscarmellose sodium）、一水乳糖（lactose monohydrate）和硬脂酸镁（magnesium stearate）。研究人员在每只兔的一只眼中结膜下注射0.03%他克莫司，在对侧眼中结膜下注射注射用水。所有兔在注射后第1天、第3天、第10天和第30天接受眼部检查。评估以下参数：流泪、充血、结膜水肿和巩膜坏死/变色。注射30天后处死兔，并对摘除的眼球进行组织病理学检查。 结果：两组均未观察到流泪或巩膜坏死/变色。在他克莫司注射眼中，结膜充血和水肿较注射用水的对照眼轻微，后者初期出现严重充血但随时间改善。组织病理学检查显示，他克莫司组淋巴细胞浸润较少，巩膜和角膜结构保存较好。 结论：结膜下注射他克莫司显示出良好的安全性。临床和病理学均未观察到严重不良事件。

一、研究背景与目的

免疫调节剂在医学多个领域具有广泛的生物学效应，其在眼科的应用已得到确立，包括过敏性眼病、干眼症、移植物抗宿主病和葡萄膜炎等。糖皮质激素长期以来被视为许多此类疾病的主要治疗手段，但其潜在副作用如眼压升高、角膜感染、白内障和青光眼等问题促使研究者积极寻找更安全有效的替代方案。环孢素A（cyclosporine A）和他克莫司（tacrolimus）两种主要局部免疫调节剂已被证明在管理眼部免疫介导的炎症性疾病中有效。尽管它们可能不如局部糖皮质激素起效迅速，但对于需要长期治疗的耐药病例更为安全，总体耐受性良好且仅伴有轻微副作用。

然而，局部给药虽方便，但临床医生常面临患者依从性问题，尤其对于需要多次滴眼、对治疗时长感到沮丧的患者，以及常患春季角结膜炎（vernal keratoconjunctivitis，VKC）且家长难以正确滴药的儿科患者。此外，为维持数小时的有效治疗浓度，实际所需药物浓度往往更高，导致刺激症状等副作用而妨碍后续治疗。结膜下注射的生物利用度高于滴眼液，因结膜表面积大且通透性好而在临床上常用，可减少每日多次滴眼的需求，提高患者便利性和生活质量。本研究旨在评估他克莫司在兔眼中结膜下注射的安全性。

二、研究方法概述

研究纳入10只2月龄正常健康新西兰白兔，体重1500至2300 g，经筛查无眼部疾病。采用既往临床研究中最常用的0.03%浓度他克莫司，在无菌条件下将注射用水加入1000 μg他克莫司胶囊（Prograf）配制而成。每只兔右眼上穹窿结膜下注射0.03%他克莫司0.5 ml（150 μg），左眼注射等量注射用水作为对照。注射前30分钟按3 mg/kg肌注赛拉嗪（Xylazine）镇静。注射后第1、3、10和30天由同一检查者采用主观评分系统评估流泪、结膜充血、结膜水肿和巩膜坏死等参数。第30天处死所有兔并摘除眼球，注射部位标记后置于稀释甲醛中保存，随后进行组织病理学检查。组织经自动旋转组织处理机处理，石蜡包埋切片，苏木精-伊红（H&E）染色，每张切片在多个放大倍数下观察超过15个视野，计算平均淋巴细胞数并进行比较。统计学分析采用SPSS软件20.0版，正态性检验用Shapiro-Wilk检验，非正态分布定量变量采用Mann Whitney检验，显著性水平设为5%。研究方案经亚历山大大学医学院伦理委员会批准（IRB编号：0301848），遵循ARRIVE指南和赫尔辛基宣言原则。

三、研究结果

临床观察结果：两组在注射后第1、3、10和30天均未观察到流泪或巩膜坏死/变色。他克莫司注射眼的结膜充血和水肿较注射用水对照眼轻微。注射用水对照眼初期出现严重充血但随时间改善。注射用水对照眼在整个研究期间的结膜充血较他克莫司注射眼更明显，在第1天和第3天具有统计学显著性。同样，注射用水对照眼的结膜水肿较他克莫司注射眼更明显，但无统计学显著性。

组织病理学结果：组织病理学检查显示，他克莫司注射眼的淋巴细胞浸润较注射用水对照眼少。他克莫司组的巩膜和角膜结构保存较好。他克莫司组巩膜厚度均匀（350–450 μm），角膜厚度为300–350 μm，巩膜、角膜、虹膜或脉络膜中淋巴细胞浸润数量较少。注射用水组巩膜厚度减少（180–220 μm），角膜厚度为170–210 μm，淋巴细胞浸润数量增加，主要位于虹膜和脉络膜，其次为巩膜和角膜。第10天和第28天分别死亡的第9号和第4号兔的摘除眼球也显示了类似的组织病理学发现。

四、讨论与结论

他克莫司是一种强效免疫抑制药物，最初用于预防移植器官的异体排斥反应。它是一种大环内酯类抗生素，1984年首次通过发酵筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）分离产生。他克莫司曾被称为FK506，因其与T淋巴细胞中的FK506结合蛋白结合而得名，具有强效免疫调节特性。不同形式和浓度的局部他克莫司已在慢性过敏性眼病的治疗中得到评估，目前主要有软膏和混悬液两种形式，浓度从0.005%到0.1%不等。即使在较低浓度下，局部他克莫司也被证明与局部糖皮质激素同样有效。在难治性VKC和特应性角结膜炎（AKC）病例中，他克莫司显著改善了畏光、瘙痒、发红、眼部不适、异物感和分泌物等症状以及结膜充血、角膜缘浸润、Tranta点、结膜乳头肥大和浅层点状角膜病变等体征。他克莫司解决和管理VKC和AKC所致巨乳头的能力优于环孢素A。

局部他克莫司的主要副作用包括眼部刺激、瘙痒、水肿、短暂烧灼感、结膜充血和结膜水肿。尽管有效，但一些研究表明烧灼感是患者停药的主要原因。在本研究中，研究人员测试了0.03%他克莫司结膜下注射作为替代途径，并在10只兔眼与10只注射用水对照眼中评估其安全性。两组均无流泪，表明该途径不具有局部途径的刺激效应。他克莫司组总体充血和水肿较轻，注射后无一只他克莫司眼出现严重充血或水肿，而注射用水组有4只眼出现随时间消退的严重充血。这可用他克莫司的抗炎作用解释。两组注射部位均可能发生针刺引起的创伤性结膜炎症。

最重要的是，两组均无巩膜坏死或变色。尽管结膜下注射他克莫司可能引起巩膜融解的担忧，但本研究未观察到眼部组织坏死。组织病理学证实了这些发现，对照组淋巴细胞浸润较他克莫司组更明显，符合他克莫司的抗T细胞淋巴细胞作用。值得注意的是，注射用水的眼在组织病理学上显示巩膜和角膜相对较薄。这些发现可能有利于未来将结膜下他克莫司注射应用于与全身结缔组织疾病相关的巩膜炎等疾病，此类病例中巩膜软化伴即将发生的巩膜穿孔可能发生于结膜下注射类固醇后或未经治疗时。

既往研究中，研究人员评估了局部0.05%他克莫司在局部应用后进入房水的穿透性，局部应用后可在房水中检测到他克莫司。因此，局部他克莫司可能是治疗前葡萄膜炎的有前景的类固醇节约模式。结膜下注射可能进一步增强他克莫司进入眼组织的穿透性。此外，将研究结果与最新纳米技术相结合，可能有助于提供他克莫司的持续和受控释放。

研究结论：结膜下注射0.03%他克莫司在兔眼中临床和组织病理学上均为耐受良好的给药途径。需要进一步研究以详细阐述该方法的有效性以及最佳浓度、剂量和治疗持续时间。