《Scientific Reports》：Micropropagation protocol of Nepenthes alata Blanco for the enhancement of secondary metabolite biosynthesis and in vitro bioactivity
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Nepenthes alata Blanco是一种以独特捕虫器形态为特征、具有作为珍贵生物活性化合物来源潜力的观赏性食虫植物。本研究旨在建立高效的微繁殖方案以实现大规模离体繁殖，并评价母株与组织培养来源芽苗的植物化学谱及生物活性。微繁殖的最佳消毒条件为0.2%
Nepenthes alata Blanco是一种以独特捕虫器形态为特征、具有作为珍贵生物活性化合物来源潜力的观赏性食虫植物。本研究旨在建立高效的微繁殖方案以实现大规模离体繁殖，并评价母株与组织培养来源芽苗的植物化学谱及生物活性。微繁殖的最佳消毒条件为0.2%氯化汞处理20 min。在芽苗诱导方面，添加1–3 mg/L苄氨基嘌呤（BAP）的Murashige and Skoog（MS）培养基记录的芽苗数量最高，而3 mg/L异戊烯基腺嘌呤（2iP）产生的芽苗长度和叶片数最高。在生根诱导方面，不含激素的半量MS培养基含1 g/L活性炭（AC）或2 mg/L萘乙酸（NAA）观察到最高生根率。使用纯泥炭藓或与沙子或珍珠岩按1:1（v/v）混合可实现成功的驯化，植株长度良好且叶片数高。对母株（NA）和七个组织培养株系（NA1–NA7），包括无激素（NA1）、BAP处理（NA2–NA4，1–3 mg/L）和2iP处理（NA5–NA7，1–3 mg/L）样品的分析表明，在组织培养株系中，NA2表现出最高的总酚和缩合单宁含量。NA2还与增强的抗氧化活性（DPPH和ABTS）以及对所评价的炎症相关酶、碳水化合物水解酶和乙酰胆碱酯酶的显著体外抑制活性相关。己烷可溶部分的GC–MS分析表明所分析样品的非极性代谢物谱存在变异。组织培养株系通常表现出较低的三萜类和萘醌类相对丰度以及较高的脂肪酸相对丰度。这些结果表明，优化的微繁殖为N. alata的大规模繁殖提供了有效途径，同时增强了生物活性代谢物的产生。
**研究背景与意义**
Nepenthes alata Blanco（翅状猪笼草）是分布于菲律宾、婆罗洲、马来西亚和苏门答腊的食虫植物，为全球栽培最广泛的猪笼草物种之一。尽管已有关于其生理学和食虫综合征的研究报道，但该物种尚未经过药理学研究。Plumbagin（5-羟基-2-甲基-1,4-萘醌）最初从Plumbago zeylanica等植物根部分离，也已在多种猪笼草中被鉴定，具有抗菌、抗炎和抗癌活性。本研究旨在建立高效的微繁殖方案以实现N. alata大规模周年生产，并评价增殖阶段细胞分裂素类型和浓度对所得组织培养株系植物化学谱和体外生物活性的影响。母株作为比较植物化学和生物学评价的参考，而细胞分裂素处理的效果主要通过相同离体培养条件下维持的组织培养株系之间的比较来评估。
**关键技术方法**
研究人员以埃及El-Zohria植物园栽培的N. alata为材料（凭证标本No.12-9-25-F存放于开罗大学药学院生药学系标本馆），采用MS培养基进行组织培养，比较了BAP和2iP不同浓度对芽苗增殖的影响；生根阶段测试了全量和半量MS培养基配合活性炭（AC）和萘乙酸（NAA）的八种配方；驯化阶段使用泥炭藓及其与沙或珍珠岩的混合基质。植物化学分析采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量、酸化香草醛-HCl法测定缩合单宁，GC-MS分析己烷可溶部分非极性代谢物。体外生物活性评价包括抗氧化（DPPH、ABTS、还原力）、抗炎（蛋白酶抑制和蛋白变性抑制）、抗阿尔茨海默（乙酰胆碱酯酶抑制）和抗糖尿病（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制）活性测定。
**研究结果**
*外植体消毒*：0.2%氯化汞处理20 min在67.0%外植体存活率和44.66%无菌外植体率之间提供了实用平衡，被认为是最适处理。
*芽苗增殖*：添加BAP的MS培养基产生最高芽苗数（3.00–3.12个/外植体），而3 mg/L 2iP记录到最高芽苗长度（1.64 cm）和叶片数（8.72片/芽苗）。所有BAP或2iP浓度均产生高于无激素对照的鲜重，干重无显著差异。
*生根行为*：半量MS培养基无激素或含1 g/L AC均达到100.0%生根率，含2.0 mg/L NAA达91.67%。最佳根数为半量MS无激素（15.33根/芽苗）或含1 g/L AC（13.93根/芽苗）。全量和半量MS无激素培养基均记录到最长根长（各1.83 cm）。
*驯化*：三种基质（纯泥炭藓、泥炭藓+沙1:1、泥炭藓+珍珠岩1:1）均给出良好生长，对植株长度或叶片数无显著影响。
*总酚含量*：母株为222.49 ± 0.23 mg GAE/100 g，NA1为238.76 ± 0.23 mg GAE/100 g。最高酚类浓度见于NA2（BAP 1.0 mg/L），为307.34 ± 0.31 mg GAE/100 g。2iP处理株系随浓度增加酚类水平降低（NA5: 250.63 ± 0.25；NA6: 248.93 ± 0.25；NA7: 241.00 ± 0.23 mg GAE/100 g）。
*总缩合单宁*：模式与总酚一致。母株最低（87.25 ± 0.09 μg/mL），NA1为93.63 ± 0.09 μg/mL，NA2最高（120.53 ± 0.12 μg/mL）。2iP处理株系单宁含量低于BAP处理但略高于母株。
*GC-MS代谢物谱*：母株代谢组以lup-20(29)-en-3-one（22.71%）、β-谷甾醇（12.55%）、α-生育酚（10.78%）、β-香树脂酮（9.33%）和plumbagin（6.91%）为主。所有组织培养株系这些次生代谢物相对丰度较低，脂肪酸相对丰度较高。Plumbagin在母株中相对丰度（6.91%）高于组织培养样品（NA3的2.15%至NA7的3.93%）。n-十六烷酸（棕榈酸）从母株的3.81%升至NA2的15.31%和NA3的15.58%。9,12-十八碳二烯酸（亚油酸）从母株的2.19%峰值升至NA3的17.3%。9,12,15-十八碳三烯酸（亚麻酸）从母株的4.2%升至NA1的17.9%。β-谷甾醇在所有样品中保持较高（13.99%–16.0%），甾醇代谢相对保守。α-生育酚在所有培养物中急剧下降（2.47%–3.96%），而γ-生育酚从母株的1.8%升至NA4的7.29%。三萜类显著降低：lup-20(29)-en-3-one从母株的22.71%降至培养物的4.57%–8.12%，β-香树脂酮从9.33%降至3.38%–6.48%。2iP处理株系（NA5–NA7）甾醇和三萜相关代谢物相对丰度较高。
*抗氧化活性*：NA2表现出最佳抗氧化性能，总抗氧化能力（TAC）为192.34 mg GAE/g，铁还原力（IRP）为174.86 μg/mL，显著超过母株（107.49 mg GAE/g和97.72 μg/mL）。NA2在ABTS assay中达67.08%、DPPH assay中达57.33%抑制率，接近抗坏血酸参考值（ABTS 71.34 ± 0.02%，DPPH 63.28 ± 0.02%）。NA2的IC??值为ABTS 3.45 μg/mL、DPPH 4.83 μg/mL，接近抗坏血酸（ABTS IC?? = 3.24 μg/mL；DPPH IC?? = 4.38 μg/mL）。
*抗炎活性*：NA2表现出最高的体外抗炎活性，蛋白变性抑制为45.45%、蛋白酶活性抑制为42.35%。NA3和NA4也显示较高抑制活性（两项测定均超过30%）。母株抑制值分别为27.18%和24.08%。阳性对照双氯芬酸钠在蛋白变性 assay中产生49.52%抑制、蛋白酶活性 assay中产生46.77%抑制。NA2的蛋白酶抑制IC?? = 7.26 μg/mL，双氯芬酸钠IC?? = 6.58 μg/mL，母株IC?? = 12.77 μg/mL。
*抗阿尔茨海默活性*：NA2和NA4表现出最高的AChE抑制活性，分别达58.49%和58.61%，约为母株（24.67%）的2.37倍和2.38倍。NA3也显示较高AChE抑制活性（57.81%）。NA2、NA4和NA3的IC??值分别为4.88、4.87和4.94 μg/mL。阳性对照多奈哌齐产生74.54%抑制，IC?? = 3.83 μg/mL。
*α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性*：组织培养株系高于母株。NA2抑制活性最高，α-淀粉酶抑制为53.66%、α-葡萄糖苷酶抑制为43.33%。阳性对照阿卡波糖抑制值分别为67.68%和57.18%。NA2的IC??值最低（α-淀粉酶 = 2.56 μg/mL；α-葡萄糖苷酶 = 1.89 μg/mL）。母株抑制活性最低（α-淀粉酶29.99%、α-葡萄糖苷酶19.74%），IC??分别为4.57 μg/mL和3.39 μg/mL。
**讨论与结论**
讨论部分指出，BAP比2iP更有效地增强N. alata酚类化合物产生，这与橄榄和Kaempferia parviflora等物种的观察一致。单宁含量在BAP处理培养物中积累高于2iP处理培养物，与Alchemilla mollis和Chamerion angustifolium的报道一致。GC-MS分析进一步表明2iP处理株系甾醇和三萜相关代谢物相对丰度高于BAP处理株系，与甘蓝（Brassica oleracea var. sabellica）中细胞分裂素类型影响甾醇、脂肪酸和生物碱组成的报道一致。NA2最高的抗氧化活性与其升高的总酚和单宁含量相关。较高BAP浓度下活性下降可能反映细胞分裂素诱导的活性氧（ROS）积累和代谢改变，但该机制仍为假设，因本研究未直接评价ROS参数。组织培养芽苗中鉴定的脂肪酸包括9,12,15-十八碳三烯酸（α-亚麻酸）、9,12-十八碳二烯酸（亚油酸）、十八烷酸（硬脂酸）和n-十六烷酸（棕榈酸）也可能 contributed to 观察到的抗氧化活性。抗炎活性增强可能与较高的酚类和缩合单宁含量相关，这些植物化学物已被报道通过抑制环氧化酶、脂氧合酶、白细胞介素和核因子-κB（NF-κB）调节炎症通路。NA2–NA4中观察到的AChE抑制伴随升高的总酚和单宁含量，酚类化合物已被报道通过π-π相互作用、疏水作用和氢键与酶催化位点残基相互作用抑制AChE，同时发挥抗氧化和抗炎效应贡献神经保护。γ-生育酚在NA2–NA4己烷提取物中检测到高水平，有效清除ROS和活性氮 species（RNS），调节炎症介质包括环氧化酶-2（COX-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。NA2对碳水化合物消化酶的抑制活性可能归因于高浓度酚类和单宁，以及多种脂肪酸包括9,12,15-十八碳三烯酸、9,12-十八碳二烯酸、11-十八碳烯酸、n-十六碳烯酸和十八烷酸也被报道抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性。研究局限性包括：生物活性仅用体外 assay评价，可能不能准确反映体内药理学行为；研究集中于粗提物，未分离或结构表征负责观察到的活性的特定生物活性成分；生物活性用粗乙醇提取物评价而GC-MS分析己烷部分主要代表非极性成分，因此所鉴定化合物与观察到的生物活性之间的任何直接关联基于先前文献应谨慎解释；GC-MS峰面积百分比为半定量代表相对而非绝对化合物丰度；母株和离体来源芽苗在生理状态、发育阶段和生长环境方面存在差异，因此它们之间的比较应视为描述性的，细胞分裂素处理的特定效果最好通过比较相同培养条件下维持的组织培养株系来解释。
结论部分译为：本研究建立了N. alata的高效微繁殖方案，并证明组织培养与植物化学谱变化相关，且与母株相比显著增强了乙醇提取物的生物活性。在所有变异体中，NA2（培养于添加1.0 mg/L BAP的MS培养基）表现出最高的总酚和缩合单宁含量，这与增强的抗氧化活性及对炎症相关酶、碳水化合物水解酶和乙酰胆碱酯酶的体外抑制相关。己烷可溶代谢物的GC-MS代谢谱分析表明，组织培养条件与代谢物组成变化相关，包括不饱和脂肪酸和γ-生育酚水平增加，这些可能贡献于观察到的生物活性。总体而言，结果突出了组织培养作为N. alata大规模繁殖和生物活性代谢物可控生产的有效途径的潜力，从而减少对野生植物采集的依赖。然而，需要进一步研究聚焦于生物活性化合物分离、协同相互作用和体内验证，以更好地理解这些发现的药理学意义。
