基于内生细菌代谢物与精油复合的溶液吹纺纤维抗菌伤口敷料

《Polymer Bulletin》：Endophytic bacterial metabolites from Anacardium humile combined with essential oils in solution blow spun fibers for antimicrobial wound dressings

　　

皮肤创面是微生物定植的主要入口，若未及时处理，常导致感染并可能进展为全身性并发症。尽管抗生素已被用于治疗此类感染，但其广泛使用加剧了日益严重的抗菌药物耐药性（AMR）问题。因此，内生细菌代谢提取物与精油等天然生物活性化合物已成为对抗多重耐药性的有前景的替代方案。本研究考察了一种基于分离自巴西塞拉多（Cerrado）原生植物Anacardium humile的内生细菌、与精油复合并负载于聚合物纤维中的抗菌配方。为此，研究人员从A. humile的枝条和叶片中分离内生细菌，对大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和白色念珠菌（C. albicans）拮抗作用最强的两株菌经分类学鉴定为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。研究人员优化了这些内生细菌代谢提取物（ME）的生产，并将细菌ME与丁香精油和柠檬烯精油（EO）复配，开发出天然抗菌配方，所得配方对受试病原体表现出抗菌作用。这些ME-EO配方通过溶液吹纺技术被包封于可生物降解的聚乳酸（PLA）/聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）共混物纤维中，从而制得抗菌伤口敷料。所得纤维基伤口敷料对受试病原体既表现出抑菌圈形成，也表现出接触式抗菌活性。此外，与非包封的天然抗菌配方相比，所制ME-EO纤维对成纤维细胞的细胞毒性显著降低。上述结果凸显了将内生细菌代谢物与精油复合于聚合物纤维中作为开发生物活性伤口敷料策略的潜力。

研究背景与意义

抗菌药物耐药性（AMR）是21世纪最紧迫的全球健康挑战之一，耐药微生物的快速出现与全球传播削弱了传统抗生素的有效性。天然产物因能通过多种且常互补的生化机制作用于微生物细胞而受到越来越多的关注。生物多样性丰富且开发不足的生态系统是新型生物活性化合物的宝贵储库。巴西塞拉多（Cerrado）被公认为全球生物多样性热点地区，蕴藏丰富的植物及关联微生物，其中内生细菌能够产生结构多样的次级代谢产物。Anacardium humile（当地称cajuzinho-do-cerrado）是塞拉多生物经济的重要物种，其富含抗坏血酸和酚类抗氧化剂等生物活性成分。植物内生微生物组是尚未充分开发的重要生物活性次级代谢产物储库，这些微生物无症状地栖居于植物组织内，合成结构多样的化合物，在宿主防御入侵病原体过程中发挥关键作用，其机制为细菌拮抗作用，即一种微生物通过产生可扩散的次级代谢产物抑制另一种微生物生长。精油（EO）是另一类有前景的天然抗菌剂，通过膜破坏、酶抑制及干扰胞内靶点发挥抗菌活性，其多靶点作用模式降低了细菌产生耐药性的可能性，但存在高挥发性、对光和氧化敏感、环境条件下不稳定等局限。将精油与内生细菌来源的代谢提取物复合，可使两类来源的结构多样生物活性化合物通过互补机制发挥作用；物理掺入聚合物基质则为保护挥发性化合物和调控其释放提供了有前景的途径。在此方向上，本研究拓展了既往基于内生菌的天然抗菌配方研究，将其负载于伤口敷料并评价其用于皮肤组织修复的潜力。

关键技术方法

研究人员从A. humile枝条和叶片分离纯化内生细菌（IEB），以琼脂孔扩散法筛选对皮肤病原体的拮抗活性，经16S rDNA扩增与测序进行分类学鉴定；通过生长动力学监测与不同培养时间抑菌圈评价优化代谢提取物（ME）生产，并与精油复配构建天然抗菌配方；采用溶液吹纺（SBS）技术制备Ecovio?（PLA/PBAT共混物）纤维敷料；通过扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）和接触角测定表征材料，并以琼脂扩散法和细胞毒性实验评价其抗菌与生物相容性。植物材料采自巴西圣保罗州联邦大学塞拉多环境保护区（GPS坐标21°58'34.3"S 47°52'08.8"W），采集时间为2024年2月。

研究结果

A. humile内生微生物组的抗菌活性：对65株IEB的形态学与形态染色分析显示，11株为革兰阴性、54株为革兰阳性；2株呈球菌形态，63株呈杆菌形态。从65株IEB获得15份ME，筛选结果显示29株无可检测抗菌活性，7株仅抑制E. coli，6株仅抑制S. aureus，2株仅抑制C. albicans；10株同时抑制E. coli与S. aureus，2株同时抑制E. coli与C. albicans，5株同时抑制S. aureus与C. albicans；仅4株对三种病原体均表现拮抗。依据抑菌圈最显著者选出两株进行后续研究，分类学鉴定为B. subtilis（BS）与B. amyloliquefaciens（BA）。16S rDNA扩增产物电泳显示BS约1500 bp、BA约1400 bp的清晰条带，与分子量标记相符。

A. humile内生菌ME的优化及其与EO的复配：生长曲线显示两株菌的指数期约在8至30 h，稳定期约在30至94 h，提示次级代谢产物主要在指数期后期和稳定期早期产生并释放至培养液。抑菌圈评价显示，培养24 h和48 h所得提取物对受试病原体抑制活性最高，故选定48 h为BSME和BAME的优化培养时间。精油在12.5%、6.25%、3.12%、1.55%和0.78%（v/v）浓度下测试，浓度高于12.5%时抑制值保持恒定，且EO浓度至12.5%未进一步提高ME抗菌活性。ME-EO复配配方对全部受试病原体均有抑制活性，对C. albicans作用更明显（96 h的BAME及96 h的BSME+BAME组合除外）。CEO与LEO抗菌活性较强，BEO对C. albicans活性较高。BSME与LEO复配增强了对S. aureus和C. albicans的抑制；BAME与LEO复配在12.5%浓度下增强了对全部受试微生物的活性，BAME与CEO复配改善了对S. aureus的抑制。BSME+BAME与BEO、LEO复配增强了对全部受试病原体的活性，尤其对E. coli和C. albicans。CEO与LEO表现出最一致的抗菌活性增强作用，被选用于后续纤维体系负载。对C. albicans，最高抑菌圈（17–19 mm）见于B. subtilis单培养（24和48 h）及B. subtilis与B. amyloliquefaciens共培养（48 h）的ME，CEO及CEO、LEO、BEO三元精油混合物抑菌圈分别为18.7和18 mm，统计学无显著差异；较长培养时间（72和96 h）提取物及单独LEO、BEO及其二元组合活性显著降低。对E. coli，LEO及其与BEO组合抑菌圈最大（约20.3 mm），与单独BEO及24 h共培养提取物统计学同组。对S. aureus，LEO抑菌圈最大（21 mm）。统计分析证实抗菌活性受培养时间与配方组成强烈影响，早期发酵阶段（24–48 h）提取物持续表现更高活性。研究人员同时指出，琼脂扩散法不能对相互作用作确定性分类，所观察效应应解释为抑制活性差异而非协同、相加、无关或拮抗的证据，需进一步棋盘试验测定分数抑菌浓度指数加以表征。

含活性成分聚合物纤维的制备：纤维垫照片显示含CEO者形貌较均匀、缺陷少，含LEO者结构较脆。FTIR谱图主要呈现Ecovio（PLA/PBAT共混物）相关谱带，包括C-C、C-H、C-O、C=O、C-O-C键及酯、羧酸、芳环等官能团；约2947 cm^?1为C-H键，1711和1750 cm^?1归属酯羰基（C=O）伸缩，1182 cm^?1证实C-O与C-O-C键存在，1450 cm^?1关联CH₃不对称弯曲振动。约1650 cm^?1和1540 cm^?1及2850–2960 cm^?1区C-H伸缩振动常与细菌代谢物相关，证实脂肽和胞外蛋白等关键组分存在。CEO谱图在3100–2990 cm^?1区有C-H伸缩振动带，1450–1600 cm^?1关联芳环C-C伸缩，约1639 cm^?1关联烯烃C=C键，约1510 cm^?1和3100 cm^?1关联典型芳烃振动，约3460 cm^?1宽峰证实酚类化合物特征羟基（–OH）。LEO谱图中2920–2830 cm^?1归属脂肪族C-H伸缩，约1640 cm^?1证实C=C双键，约1440 cm^?1和880 cm^?1分别关联=CH₂变形与面外C-H弯曲。聚合物垫FTIR谱未见新谱带或显著位移，表明聚合物基质与所负载生物活性化合物之间未发生化学相互作用，生物活性化合物以物理方式掺入并保持原有化学结构。SEM显示纤维随机取向、表面光滑、直径不均、偶有珠粒；含ME与CEO+LEO的纤维垫出现纤维融合和塌陷等更明显缺陷；含CEO者直径分布较其他配方更均匀，可能与溶液流变性质改变、成纤过程中射流更稳定有关。平均直径方面，Ecovio/BAME+CEO为900±50 nm，Ecovio/BAME+LEO为950±67 nm，Ecovio/BAME+CEO+LEO为950±90 nm；Ecovio/BSME+CEO为860±36 nm，Ecovio/BSME+LEO较高为1144±102 nm，Ecovio/BSME+CEO+LEO为960±66 nm。接触角测定显示含CEO样品呈明显亲水性，表明纤维垫表面对水分高亲和，有利于渗出液吸收、改善与皮肤黏附并维持利于愈合的湿润环境；纤维垫润湿性随所掺入化合物而变化，说明精油和代谢提取物均影响材料表面性质。

纤维伤口敷料的抗菌活性与细胞毒性：纤维垫的抗菌性能通过抑菌圈试验评价，以确定天然抗菌配方的负载是否保持了游离ME及ME与EO复配时原有的抗菌活性，受试对象为C. albicans、E. coli和S. aureus。细胞毒性方面，人真皮成纤维细胞（HDFn）在含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养，于37 °C、5% CO₂湿润培养箱中维持，每2–3天更换培养基至约90%汇合；以96孔板、3 mm直径聚合物圆片暴露24 h后评价细胞毒性，采用标准生化法测定细胞代谢活性与一氧化氮产生，全部实验一式三份。结果显示，所制ME-EO纤维对成纤维细胞的细胞毒性较非包封天然抗菌配方显著降低。

讨论与结论

本研究将基于内生菌的天然抗菌配方负载于伤口敷料并评价其皮肤组织修复潜力。结果表明，从A. humile分离的内生细菌中，B. subtilis与B. amyloliquefaciens对E. coli、S. aureus和C. albicans拮抗作用最强；其代谢提取物在培养48 h时抗菌活性最佳，与丁香精油和柠檬烯精油复配后抗菌作用增强；经溶液吹纺技术负载于PLA/PBAT（Ecovio?）可生物降解纤维后，纤维基伤口敷料对受试病原体既形成抑菌圈又表现接触式抗菌活性，且对成纤维细胞的细胞毒性较非包封配方显著降低。研究结论为：将内生细菌代谢物与精油复合于聚合物纤维中，是开发生物活性伤口敷料的一种有前景的策略。