《Antioxidants》：Lycium ruthenicum Murr. Polysaccharide Attenuates Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice by Modulating Inflammation, Antioxidant Defense, and Gut Microbiota
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黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）多糖（LRP）作为黑果枸杞的主要成分，具有多种生物活性。肺纤维化（PF）常作为急性肺损伤的长期后果出现，以肺组织进行性瘢痕形成和肺功能不可逆下降为特征。持续性炎症反应、氧化应激及肠-肺轴紊乱与PF的发生
黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）多糖（LRP）作为黑果枸杞的主要成分，具有多种生物活性。肺纤维化（PF）常作为急性肺损伤的长期后果出现，以肺组织进行性瘢痕形成和肺功能不可逆下降为特征。持续性炎症反应、氧化应激及肠-肺轴紊乱与PF的发生发展密切相关。本研究旨在从黑果枸杞中提取LRP，并在博来霉素（BLM）诱导的小鼠PF模型中系统评价其保护作用及潜在机制。结果表明，LRP处理显著减轻了肺泡结构破坏、炎性细胞浸润及纤维化病变。这些保护作用与调节炎症细胞因子以及通过增加超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）水平增强抗氧化能力有关。此外，LRP重塑了肠道微生物群落结构。总之，这些发现为LRP的肺保护特性提供了新见解，并支持其作为PF潜在天然治疗剂的应用前景。
研究背景方面，肺纤维化（PF）是一种致死性间质性肺病，以肺实质慢性进行性瘢痕形成为特征。临床上相当比例的PF病例由未解决的急性肺损伤（ALI）长期演变而来，当ALI诱导的炎症持续存在或组织修复调控机制失调时，生理性肺再生被病理性创伤愈合所取代，最终导致PF。PF的标志是细胞外基质（ECM）过度沉积和异常重塑，逐渐破坏正常肺泡结构、降低肺顺应性并损害气体交换。活化的肌成纤维细胞介导的成纤维细胞灶形成是PF的定义性病理特征之一，驻留和浸润的成纤维细胞异常分化为肌成纤维细胞，表现为α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增加及ECM合成与分泌增强，最终导致损伤肺内纤维结缔组织过度积聚、不可逆瘢痕形成和肺功能进行性恶化。此外，肠道菌群失调被认为是PF进展的关键驱动因素，肠道微生物生态系统破坏减少有益微生物代谢产物产生，导致转化生长因子-β（TGF-β）信号通路持续激活，并可促进真菌β-葡聚糖诱导的上皮-间质转化（EMT），加速成纤维细胞活化、胶原过度沉积和PF进展。目前PF一线药物治疗主要为人源抗纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布，但临床疗效有限且常伴明显不良反应和器官毒性，长期给药与肝毒性及胃肠道紊乱等并发症相关，且对PF复杂病理网络疗效有限。相比之下，天然植物多糖因安全性好、毒性低及多靶点作用而受到日益关注，新兴证据表明植物多糖可同时促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化、抑制EMT并恢复肺泡上皮屏障完整性，从而发挥抗纤维化和肺保护作用。黑果枸杞富含多糖、花青素、黄酮和微量元素等多种生物活性成分，其中许多成分水平显著高于普通枸杞。LRP是从黑果枸杞果实中提取的生物活性多糖，已报道可有效清除过多自由基、抑制肿瘤细胞增殖、抑制促炎细胞因子表达，具有强抗氧化和抗炎活性。机制上，LRP主要通过抑制Toll样受体4/核因子-κB信号通路和抑制促炎细胞因子产生发挥抗炎作用。药理学研究还表明LRP能调节肠道菌群的组成和功能，并通过调节肠道菌群发挥益生元特性，促进Lactobacillus和Bifidobacterium等有益菌增殖，同时抑制肠杆菌科致病菌的肠道定植。尽管LRP在代谢综合征、肝损伤等疾病模型中的治疗潜力已被广泛研究，但其对PF的保护作用及潜在机制仍 largely 未知。因此，本研究建立BLM诱导的小鼠PF模型，以评估LRP对PF的治疗作用并探讨其潜在机制。
研究人员开展了以下研究：从黑果枸杞中提取LRP并进行表征，采用BLM（5 mg/kg）气管内滴注建立小鼠PF模型，将48只雄性C57BL/6J小鼠随机分为Control、BLM、L-LRP（100 mg/kg）和H-LRP（400 mg/kg）四组，BLM给药7天后开始灌胃给予LRP，每日一次连续21天。研究得出，LRP处理显著减轻肺泡结构破坏、炎性细胞浸润和纤维化病变，这些保护作用与调节炎症细胞因子及通过增加SOD活性和GSH水平增强抗氧化能力有关，此外LRP重塑了肠道微生物群落结构。这些发现为LRP的肺保护特性提供了新见解，并支持其作为PF潜在天然治疗剂。其重要意义在于为PF的综合管理和辅助治疗提供了有前景的天然候选药物，并首次系统揭示了LRP通过多机制（抗炎、抗氧化、调节肠-肺轴）发挥抗PF作用。
关键技术方法方面，研究人员采用超声辅助热水提取法制备LRP，并用苯酚-硫酸法测定总糖含量、FT-IR分析官能团、HPLC分析单糖组成、高效凝胶渗透色谱测定分子量、UV-Vis光谱检测纯度。动物实验采用BLM气管内滴注诱导PF模型，C57BL/6J小鼠（8周龄，20–25 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司）随机分组，LRP灌胃干预21天。主要检测技术包括：肺湿干重比（W/D）测定肺水肿；支气管肺泡灌洗液（BALF）收集及炎性细胞计数和总蛋白测定（BCA法）；H&E染色结合Smith评分半定量评估肺损伤；Masson三色染色和天狼星红染色评估胶原沉积与重塑；羟脯氨酸（Hyp）含量测定；ELISA检测BALF和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平；GSH水平和SOD活性测定评估氧化应激；免疫组化（IHC）检测Col-I、α-SMA和CD73表达；16S rRNA基因V3–V4高变异区测序（Illumina NovaSeq平台，上海生工）分析盲肠内容物肠道菌群组成与多样性（每组n=3）。统计采用GraphPad Prism 9.0，正态分布且方差齐时用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较，方差不齐时用Brown–Forsythe ANOVA，菌群相对丰度差异用Kruskal–Wallis检验结合LSD事后多重比较。
研究结果方面：3.1 LRP对BLM诱导PF小鼠肺组织病理学的影响——通过H&E染色和Smith评分评估，发现LRP处理以剂量相关方式改善BLM引起的肺泡塌陷、肺泡间隔增厚、血管充血、弥漫性炎性细胞浸润、肺实变和纤维化及肺大疱，高剂量组改善最显著，减轻肺泡间隔增厚、肺泡内渗出及黏膜下和间质区炎性细胞浸润。3.2 LRP对BLM诱导PF小鼠肺纤维化的影响——通过Hyp含量测定、Masson三色染色、天狼星红染色及Col-I和α-SMA免疫组化评估，发现LRP降低Hyp含量、减少肺实质弥漫性胶原沉积和肺泡间隔增厚、使橙红色染色变得局限和碎片化、减少Col-I异常沉积和α-SMA阳性肌成纤维细胞聚集，呈剂量依赖性，高剂量组胶原沉积接近Control组。3.3 LRP对BLM诱导PF小鼠BALF蛋白含量和肺部炎症的影响——通过肺W/D比、BALF总蛋白、炎性细胞计数和ELISA检测，发现LRP显著降低W/D比（H-LRP组降至BLM组的0.71倍）、剂量依赖性降低BALF总蛋白、显著降低总炎性细胞计数（L-LRP组淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞分别下降57%、38%、37%，H-LRP组分别下降62%、60%、58%），降低BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平并升高IL-10水平，同时增加肺组织CD73阳性染色面积。3.4 LRP对BLM诱导PF小鼠全身炎症反应和抗氧化防御的影响——通过血清ELISA和肺组织GSH、SOD测定，发现LRP改善血清中TNF-α、IL-6、IL-1β升高和IL-10降低（H-LRP组三种促炎因子均显著降低，L-LRP组TNF-α和IL-1β显著降低而IL-6降低未达统计学意义），BLM组肺组织GSH下降40%、SOD活性下降54%，H-LRP组GSH显著增加58%、SOD活性显著增加87%。3.5 LRP对BLM诱导PF小鼠肠道微生物多样性的影响——通过16S rRNA基因测序分析，共鉴定5092个OTUs，三组共享2165个，Control、BLM、LRP组特有OTUs分别为557、526、603；α多样性指数组间无显著差异；β多样性（Bray–Curtis距离矩阵）PCoA显示BLM与Control组明显分离，LRP样本沿PC2分布于两组之间并沿PC1与Control组分离，NMDS显示类似模式，UPGMA聚类树显示LRP组形成独立分支，LRP组组内聚集明显高于BLM组。3.6 LRP对BLM诱导PF小鼠肠道微生物组成的影响——通过门和属水平相对丰度分析及热图，发现Bacillota、Bacteroidota和Pseudomonadota为三组最优势门，BLM诱导使Bacillota相对丰度下降、Bacteroidota显著增加、F/B比值明显降低，H-LRP处理部分逆转这些改变使F/B比值基本恢复至对照水平；属水平上BLM显著降低Lachnospiraceae NK4A136 group比例而LRP处理显著增加其相对丰度；热图显示三组组内聚类明显，BLM组若干潜在促炎 taxa 丰度增加伴短链脂肪酸（SCFA）相关有益 taxa 明显减少，LRP处理后这些差异 taxa 丰度呈明显恢复趋势。
讨论部分总结：研究人员在BLM诱导PF小鼠模型中证明LRP处理显著减轻肺纤维化，表现为组织病理结构改善、胶原沉积减少和肌成纤维细胞活化降低，且与抑制全身炎症、增强抗氧化防御和重塑肠道微生物群落相关，提示LRP通过多机制发挥抗PF保护作用。Hyp作为胶原特异性氨基酸是肺组织胶原积聚和纤维化的成熟定量标志物，BLM组Hyp含量和胶原染色升高证实胶原过度积聚，LRP使其降低支持抗纤维化作用；Col-I作为主要ECM蛋白常指示胶原沉积，α-SMA为肌成纤维细胞活化标志物，LRP降低肌成纤维细胞活化和胶原积聚提示其通过抑制肌成纤维细胞活化和病理性I型胶原沉积并促进胶原重塑发挥抗纤维化作用。肺损伤时肺泡-毛细血管屏障破坏致肺微血管通透性增加，液体和大分子持续漏入肺间质和肺泡腔促进肺水肿，持续性肺水肿可进一步加重肺泡上皮损伤、成纤维细胞活化和ECM沉积促进PF进展；BLM组W/D比和BALF蛋白含量升高提示肺通透性增加，LRP使其降低提示减轻血管渗漏和水肿。中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞是BALF中三大主要炎症相关细胞群，中性粒细胞可释放中性粒细胞胞外诱捕网激活TGF-β1信号通路促进成纤维细胞活化，巨噬细胞表型极化在调节纤维化反应中起重要作用，异常巨噬细胞活化可促进TGF-β和血小板衍生生长因子（PDGF）等促纤维化因子释放直接刺激成纤维细胞活化；LRP减少炎性细胞浸润提示其可能通过抑制早期炎症反应减轻BLM诱导的肺部炎症并潜在限制后续纤维化进展。LRP处理通过抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6释放并增加抗炎细胞因子IL-10水平调节炎症细胞因子谱，提示LRP通过调节炎症细胞因子平衡保护对抗PF。CD73作为参与腺苷生成的关键酶与巨噬细胞极化调节相关，高表达时可能促进组织修复；本研究中BLM组CD73阳性面积已升高，可能反映对损伤的代偿性抗炎反应，但此内源性上调不足以阻止纤维化进展，LRP处理进一步增加肺组织CD73阳性染色面积，伴IL-10水平升高和胶原沉积减少，提示CD73相关通路、巨噬细胞反应与LRP保护作用之间存在潜在联系，但CD73和巨噬细胞在PF中的作用具有背景依赖性，需进一步系统验证。BLM诱导PF中失调的局部肺部炎症可延伸至全身循环导致全身炎症失衡，持续升高的循环促炎细胞因子可反过来促进炎性细胞募集至肺部病变并进一步放大局部炎症反应；本研究中BLM处理小鼠的全身炎症失衡经LRP处理后改善，H-LRP组效果最明显，提示LRP对PF的保护作用可能超越局部肺部炎症微环境调节而包括更广泛的全身免疫调节效应。BLM诱导的活性氧（ROS）过度积聚可损伤肺泡上皮细胞并触发EMT促进成纤维细胞活化，过度ROS产生还可激活NLRP3炎症小体进一步加剧炎症反应；GSH是重要内源性抗氧化剂，其耗竭可增加肺组织对氧化应激损伤的易感性，SOD是抗氧化能力的关键指标，SOD活性降低反映肺内抗氧化防御受损；本研究中LRP处理后GSH水平和SOD活性增加表明内源性抗氧化防御能力增强，与既往植物多糖报道一致。肠道菌群组成和功能稳态在PF发生发展中起重要作用，PF期间肠道菌群改变以持续生态重塑和功能性微生物种群选择性变化为特征，可能通过持续产生促炎代谢产物和调节免疫细胞分化等机制促进肺纤维化进展；本研究中16S rRNA基因测序显示α多样性指数组间无显著差异，与既往研究提示α多样性可能不是评价LRP干预效果最敏感指标一致，LRP对肠道菌群的调节作用可能主要体现在具有潜在功能作用的特定微生物 taxa 富集；β多样性分析显示BLM与Control组明显分离而LRP组呈现独特群落结构而非简单回归对照谱，与BLM组相比LRP组组内聚集明显更高提示个体间变异降低，提示LRP可能将微生物群落重塑为新结构。门水平上BLM诱导明显改变肠道微生物组成并降低F/B比值，既往研究提示F/B比值可作为肠道微生物稳态指标，其降低与肠道菌群失调、肠道屏障完整性受损、全身炎症和小鼠PF进展相关，与本研究一致，既往报道植物多糖可通过调节F/B比值改善肠道菌群失调；高剂量LRP处理后这些改变部分逆转，F/B比值基本恢复至对照水平。属水平上Lachnospiraceae NK4A136 group被认为是肠道重要SCFA相关细菌 taxa，其耗竭可能导致SCFA产生减少、肠道屏障完整性受损和促炎反应增加，从而潜在加剧肺部炎症和纤维化进展；既往研究表明多种植物多糖可富集产SCFA有益 taxa 包括Lachnospiraceae NK4A136 group并增加肠道SCFA产生从而发挥抗炎作用，这些结果为LRP调节肠道菌群的潜在作用提供进一步支持。此外，肠道菌群失调可能通过损害肠道屏障完整性、增加促炎微生物代谢产物向循环易位及调节全身免疫和炎症反应促进PF发生发展，LRP对肠道菌群的调节作用因此可能与减轻肺部炎症和纤维化进展相关。总之，这些发现提示肠道菌群重塑可能有助于LRP的保护作用。
研究结论部分翻译：本研究通过气管内滴注BLM建立小鼠PF模型，探讨了LRP的保护作用及其在PF进展中的潜在调节机制。组织病理学分析表明，LRP处理显著减轻了PF的特征性病理表现，包括肺泡壁增厚、肺泡塌陷、出血和水肿，从而维护肺泡结构完整性并减少BLM诱导的肺组织破坏和炎性细胞浸润。在分子水平上，LRP通过调节促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）与抗炎细胞因子IL-10之间的平衡表现出强效抗炎作用。此外，LRP增强了抗氧化防御，表现为SOD活性和GSH水平升高。进一步地，本研究表明LRP处理与肠道微生物群落重塑相关。这些发现为LRP对抗PF的保护作用提供了新证据，提示LRP作为天然治疗剂的潜力。
