《Antioxidants》：Impact of INFOGEST In Vitro Digestion on the Phytochemical Profile and Antioxidant Activity of Different Parts of Vaccinium myrtillus L.
编辑推荐：
Vaccinium myrtillus L.（越橘）富含酚类化合物，其稳定性可能在消化过程中发生变化。研究人员对两个本地形态型（M1，较高灌木型；M2，低矮型）的枝（B）、叶（L）和果（F）的甲醇提取物以及一份商业果实样品（CF）进行了INFOGEST静态体外
Vaccinium myrtillus L.（越橘）富含酚类化合物，其稳定性可能在消化过程中发生变化。研究人员对两个本地形态型（M1，较高灌木型；M2，低矮型）的枝（B）、叶（L）和果（F）的甲醇提取物以及一份商业果实样品（CF）进行了INFOGEST静态体外消化。在粗提物以及口腔、胃、肠各阶段后测定总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、总单宁含量以及DPPH•和ABTS•+清除活性，并用LC–MS/MS对粗提物进行酚类成分分析。消化显著降低了所有采集样品的TPC和TFC；肠阶段保留率对TPC为17.6%（M2B）至27.4%（M1B），对TFC为28.1%（M2B）至55.4%（M1F）。M1B保留了最高的肠阶段TPC（143.28 μg GAE/mg提取物），M1L和M2L的TFC最高（131.94和130.07 μg RE/mg提取物）。DPPH•活性在叶和枝中下降，但在果实中升高；而果实的ABTS•+活性由约10%升至95.44%（M1F）。在消化样品中，ABTS•+活性与TPC呈负相关（r = ?0.71）。奎宁酸和绿原酸为主要成分。叶和枝值得进一步评价作为消化稳定酚类来源的价值。
一、研究背景与问题提出
Vaccinium myrtillus L.（越橘，bilberry）为杜鹃花科（Ericaceae）野生浆果，分布于温带与寒带地区，其果实可鲜食或加工，叶及营养器官亦有传统食用与药用历史。植物化学研究显示该种富含酚类化合物，包括花青素、黄酮类和酚酸，但其组成受部位、地理来源、环境条件、发育阶段和提取工艺影响显著。除果实外，叶、嫩枝及枝条作为浆果采收副产物日益受到关注，其酚类在消化过程中的行为关系到其在浸出液、营养保健品及副产物增值利用中的潜在价值。已有研究报道该种提取物的抗氧化、抗炎、抗糖尿病、神经保护、抗衰老及抗癌相关活性，并涉及血糖控制、心血管代谢指标、肠道氧化应激与肠道菌群相关代谢过程。Yuca等此前对土耳其东部黑海地区不同部位样品进行了LC-MS/MS表征及抗氧化、抗糖尿病和抗胆碱酯酶活性比较，发现部位间化学组成与生物活性差异明显。然而，样品中初始存在的生物活性物质量并不必然代表胃肠消化后仍可及的部分。膳食植物化学物的生物学相关性受其稳定性、从植物基质中的释放、转化及溶解度影响；pH、消化酶、胆盐、离子条件及基质组分相互作用均可改变其化学结构与浓度。生物可及性（bioaccessibility）指化合物在胃肠消化中从食物或植物基质释放并可能供肠道吸收的部分，因此仅测定未消化样品可能低估其摄入后的功能。标准化INFOGEST静态体外消化模型为模拟口腔、胃、肠三相生理生化条件提供了协调可重复的方法，已广泛用于蛋白质、矿物质、维生素、硫苷、异硫氰酸酯、酚类等的研究，并扩展至植物基基质与功能食品体系。已有研究表明消化可显著改变富含酚类植物材料的化学组成与测得生物活性，例如Laib等报道了蒲公英酚类在模拟消化及结肠发酵中的变化，Erol等以INFOGEST模型评价山楂果实并发现植物化学物与氨基酸生物可及性、抗氧化能力及酶抑制活性的消化相关变化。Vaccinium相关证据亦提示应考虑酚类的胃肠命运而非仅依赖初始浓度，越橘叶及相关材料研究已强调这一点。鉴于越橘果实、叶与其他部位酚类组成差异较大，而关于其不同部位在标准化胃肠消化中比较行为的信息有限，且消化诱导的植物化学变化与抗氧化活性改变之间的关系尚未充分表征，本研究据此展开。
二、研究内容与总体结论
研究人员以采自土耳其特拉布宗K?prüba?? Kutlusu Yaylas?（40°38′43.94″ N，40°06′44.07″ E；海拔1774 m）的两个自然生长形态型（M1“Dal Ligarba”较高灌木型、M2“Yer Ligarba”低矮型）的枝、叶、果甲醇提取物，以及一份购自土耳其埃尔祖鲁姆当地市场的商业干燥越橘果实产品（CF）为对象，按INFOGEST静态模型进行口腔、胃、肠序贯消化，在粗提物及各阶段测定TPC、TFC、总单宁含量与DPPH•、ABTS•+清除活性，并以LC-MS/MS表征粗提物酚类谱。结果表明，消化显著降低所有采集样品的TPC与TFC，肠阶段保留率TPC为17.6%（M2B）至27.4%（M1B）、TFC为28.1%（M2B）至55.4%（M1F）；M1B肠阶段TPC最高（143.28 μg GAE/mg提取物），M1L与M2L的TFC最高（131.94与130.07 μg RE/mg提取物）。DPPH•活性在叶与枝中下降、在果实中升高，ABTS•+活性在果实中由约10%升至95.44%（M1F）；消化样品中ABTS•+活性与TPC呈负相关（r = ?0.71）。奎宁酸与绿原酸为主要酚类。研究提示叶与枝作为消化稳定酚类来源值得进一步评价，且越橘潜在功能不能仅凭未消化植物化学组成评估；同时作者明确指出叶与枝的安全性、可食性及法规地位未在本研究中评价，其用于功能食品或营养保健品需先经毒理学与安全性评估。
三、主要关键技术方法（不超过250字）
采用甲醇浸提（20 g粉末/100 mL甲醇，室温过夜后40 °C、100 rpm摇床24 h，减压浓缩）制备枝、叶、果及商业果实粗提物；按Minekus等与Brodkorb等INFOGEST静态模型并参照Thumann等对草药提取物的修改进行口腔、胃、肠序贯消化，每样品3次独立消化、每次技术三重复；以Folin–Ciocalteu法测TPC（没食子酸当量，GAE）、AlCl3比色法测TFC（芦丁当量，RE）、PVPP差减法估算总单宁；以微孔板DPPH•与ABTS•+法测自由基清除率；以Agilent 6460三重四极杆LC-MS/MS（ESI负离子、MRM）靶向定量酚类；统计采用单因素方差分析、Tukey HSD、误差传播与Pearson相关（R 4.3.3）。样本来源为土耳其特拉布宗野生采集材料及当地市场商业产品。
四、研究结果
（一）提取率
不同部位与形态型提取率差异明显，M2F最高（38.25%），其次M1L（31.6%），两形态型枝提取率较低（10.6%与12.2%），总体果与叶高于枝。研究人员指出该差异与越橘各组织化学组成差异相符，但提取率亦受溶剂性质与提取条件强烈影响，不能单独作为酚类丰富度或生物活性的直接指标，需结合植物化学与生物学谱综合解释。
（二）模拟胃肠消化过程中的植物化学含量与抗氧化活性
TPC在部位与消化阶段间差异显著，消化前M2B与M2L最高、果实较低；消化后呈渐进且显著下降，肠阶段后M1B保留最高（143.28 μg GAE/mg提取物），商业果实样品TPC明显低于采集样品。TFC以叶样最高（M2L、M1L），消化总体下降且以胃、肠阶段降幅最明显，肠阶段后M1L（131.94 μg RE/mg提取物）与M2L（130.07 μg RE/mg提取物）保留最高，商业样品含量低但肠阶段后略有升高。总单宁在M2B与M2L粗提物中最高，枝、叶明显富于果实；消化使各样品单宁逐渐大幅下降，M1B保留最多（肠阶段0.269 μg GAE/mg提取物），其次M2L（0.204）与M1L（0.186），商业样品各阶段均未检出单宁；作者强调PVPP法仅为估算，缩合单宁需香草醛–HCl法等专门方法定量。DPPH•与ABTS•+活性模式不同：粗提物中叶、枝DPPH•清除率明显高于采集果实（M2L最高82.11%），商业样品虽酚类低但DPPH•活性亦高（81.09%）；消化后DPPH•活性在各阶段波动而非持续下降，部分样品胃阶段较高，M1B口腔阶段因有色或浑浊组分干扰517 nm测定而报为未检出。ABTS•+活性总体高于DPPH•，M2L、M2B、M1L、M1B粗提物均>97%；果实消化前ABTS•+活性低而消化后大幅升高，M1F由9.45%升至95.44%、M2F由10.44%升至83.91%。作者据此指出消化对自由基清除能力的影响随部位、形态型与测定方法而异，抗氧化活性变化并不总与总酚、总黄酮、单宁含量变化同步，可能源于基质结合态化合物的释放或结构转化生成仍具清除活性的衍生物；绿原酸在肠阶段近中性条件下可异构化并部分降解，果实花青素与黄酮可转化为保留清除能力的酚酸与醛类，但该假设尚待消化样品谱学验证。两种方法基于不同自由基体系、对个体酚类及消化产物响应不同，且粗提物在有机溶剂中测定、消化样品在近中性缓冲水相中测定，酚羟基去质子化可提高ABTS•+测定活性，故抗氧化能力宜以互补方法解释。商业样品与采集样品差异明显，可能源于基因型、产地、成熟度、栽培、加工、贮藏与基质组成；其TPC与TFC肠阶段表观保留率超过100%，作者归因于初始含量极低时消化衍生化合物对比色测定的贡献比例增大。
（三）LC-MS/MS酚类谱
奎宁酸与绿原酸为所有样品的主要化合物并在全部样品中检出，奎宁酸以M1F最高（17,964.45 ng/mL），绿原酸以M1L最高（12,789.06 ng/mL）；表儿茶素以M2B突出（1456.18 ng/mL），儿茶素主要见于M1B（739.55 ng/mL）；槲皮素见于M1B、M1L、M2B、M2L，以M2L最高（98.10 ng/mL）；没食子酸仅见于M2F（43.36 ng/mL），keracyanin chloride（矢车菊素-3-O-芸香糖苷）仅见于M2B（15.79 ng/mL），上述微量成分低于最低校准水平，应视为痕量成分。商业果实样品谱较简单，仅检出奎宁酸（1381.63 ng/mL）与绿原酸（28.58 ng/mL）。作者解释多数花青素相关化合物未检出，与靶向方法仅覆盖三种花青素相关化合物、提取条件面向总酚而非花青素（未酸化甲醇、遮阴干燥、40 °C 24 h提取、旋转蒸发浓缩）、果实成熟度及加工贮藏损失、基质效应与离子抑制等因素有关，故个别化合物未检出不应解释为植物材料中完全缺失。
（四）保留率与相关性分析
肠阶段相对粗提物的保留率：TPC为17.6%（M2B）至27.4%（M1B），TFC为28.1%（M2B）至55.4%（M1F），单宁为4.5%（M1F）至22.4%（M1B），即黄酮保留程度高于总酚与单宁，果实黄酮相对保留最高但绝对含量低；所有采集样品肠阶段TPC与TFC显著低于粗提物，商业样品TPC与TFC表观保留率超过100%归因于初始含量低时消化衍生化合物的干扰。Pearson相关显示TPC、TFC与单宁含量间强正相关，TPC与单宁近乎完全相关（r = 1.000）系单宁以PVPP差减法作为TPC一部分估算所致；全部样品与阶段合并时DPPH•与ABTS•+活性均与TPC、TFC无显著相关（r = 0.02–0.30，p > 0.05）；在消化阶段中两者与TPC（DPPH• r = ?0.49；ABTS•+ r = ?0.71）及TFC（r = ?0.51与?0.75）呈负相关，主要因酚类最低的果实与商业样品消化后ABTS•+活性高，统计上支持消化后自由基清除活性与所测植物化学含量不成比例。作者还指出研究局限：消化对象为甲醇提取物而非全植物基质，故数据描述可提取酚类的消化稳定性而非完整基质中的生物可及性；仅分析一份商业产品且缺乏产地、加工与贮藏信息，比较仅为指示性；静态INFOGEST不模拟结肠发酵、肠道吸收与代谢，结果反映体外消化稳定性而非生物利用度；各阶段序贯累积，胃、肠阶段数值反映前序条件累积效应；消化样品未作LC-MS/MS表征，活性不能归于个别代谢物；LC-MS/MS每提取物单次进样，超出最高校准水平的奎宁酸与绿原酸为外推值、部分微量成分低于最低校准水平，数据为半定量；提取物?20 °C贮存数月后分析可能造成花青素等不稳定成分损失。
五、讨论与结论
讨论指出，消化前枝与叶的酚类、黄酮与单宁一般高于果实，M2B与M2L总酚与单宁尤丰、M2L与M1L黄酮最高，说明越橘植物化学潜力不限于果实，营养器官亦为重要来源，这与Vaccinium果实、叶及其他组织植物化学多样性研究一致，越橘叶高酚含量与抗氧化潜力亦受关注。消化总体降低TPC，胃、肠阶段变化最明显，与蓝莓及相关Vaccinium种以及其他多酚丰富果实（醋栗、黑莓、桑、山茱萸、黑李、黑加仑、野樱莓、接骨木、山楂等）报道的损失或转化相似，提示为酚类丰富植物基质的共性响应。尽管总体下降，各部位损失程度不同，M1B肠阶段TPC保留最高，除初始浓度外还与化学结构及与植物基质相互作用有关；食物基质可强烈影响浆果多酚的释放、稳定性与生物可及性，故初始酚含量高不一定意味着肠阶段生物可及性高。黄酮趋势类似，叶样初始最高、消化总体降低，但M1L与M2L肠阶段仍保留较高浓度，与Vaccinium叶酚类部分可及及黑莓、覆盆子叶多酚消化后仍保留可测抗氧化与植物化学特性的观察一致。单宁变化尤为明显，消化大幅降低但M1B肠阶段最高，可能与pH变化、氧化、水解、与消化酶相互作用或与消化基质其他组分结合有关，类似转化见于浆果及其他植物基质复杂酚类；作者重申消化前测得量不能作为胃肠加工后可及部分的直接估计，且鉴于PVPP估算性质，单宁变化程度应视为指示性而非绝对值。花青素是解释上述变化的重要成分，其稳定性受胃肠pH与基质强烈影响，Fraisse等报道越橘花青素在模拟消化中显著变化，Peixoto等报道蓝莓各花青素生物可及性差异（部分malvidin衍生物行为较有利），蓝莓等富含花青素基质亦有类似证据，Prado等强调花青素生物可及性受分子结构、pH、食物基质、加工与消化条件等多因素共同制约，故本研究中总植物化学测定下降可能为降解与结构转化的综合而非原化合物完全消失。抗氧化活性变化不总与总酚、黄酮、单宁变化平行，DPPH•活性在消化中波动而非持续下降，ABTS•+模式更独特，叶与枝粗提物活性很高而初始活性低的果实在消化后显著升高；这种总植物化学含量与抗氧化能力不直接平行的现象亦见于既往消化研究，并在浆果中反复报道（野生蓝莓多酚消化改变组成与生物活性、蓝莓抗氧化变化与酚谱改变密切关联、越橘完整花青素损失不必然对应抗氧化潜力等量损失，以及安第斯蓝莓、黑莓、蓝莓果渣等）。作者提出抗氧化活性保持或增强的可能解释是消化同时降解部分母体分子并促进基质结合态化合物释放、结构转化生成保留甚至具显著清除活性的衍生物，类似现象见于紫米花青素、葡萄渣、草莓多酚、Lycium ruthenicum花青素、Prinsepia utilis酚类、Kadsura coccinea果实及黑莓、桑等，但消化样品未作LC-MS/MS谱学表征，该假设仍待验证。方法学上，DPPH•与ABTS•+基于不同自由基体系、对个体酚类及消化产物响应不同，可解释ABTS•+在总酚与单宁明显下降时仍保持很高；粗提物在有机溶剂、消化样品在近中性缓冲水相中测定，酚羟基去质子化使ABTS•+活性随pH升高，可能贡献消化果实与商业样品较高ABTS•+值；故抗氧化能力宜以互补方法而非单一方法解释。消化诱导转化的生物学意义可能超出直接自由基清除，消化浆果酚类及代谢物在多种模型中与抗增殖、抗炎、抗糖氧化、降血糖及肠道相关效应相关，Fraisse等显示胃肠条件可改变cyanidin-3-O-glucoside的抗糖氧化与α-葡萄糖苷酶抑制性质，Giampieri等与Lovi?等显示浆果来源酚类消化后仍可保留生物学效应，说明消化稳定性与生物学功能相关但不等同。商业样品与采集样品差异显著，其初始TPC、TFC明显较低且未检出单宁，但消化中部分抗氧化活性保持或升高；浆果样品差异可源于基因型、产地、成熟度、栽培、加工、贮藏与基质组成，野生与栽培Vaccinium变异及野生与商业黑莓消化稳定性与抗氧化差异均有报道；商业样品虽无检出单宁且TPC、TFC低，仍显示ABTS•+活性，因ABTS•+不仅响应单宁，还响应包括该样品检出的奎宁酸与绿原酸等非单宁酚类、黄酮及干燥加工中形成的不被酚类测定捕捉的非酚还原物（如抗坏血酸），结合pH依赖性反应性可解释其消化阶段高ABTS•+值。综上，模拟胃肠消化显著重塑越橘植物化学与抗氧化特征，总酚、黄酮与单宁总体下降与Vaccinium及其他多酚丰富果实文献一致，而部分消化样品抗氧化活性保持或增强说明植物化学损失不必然意味着功能活性丧失；采用包封或保护性递送系统的研究亦支持二者可区分。研究强调不仅应评价未消化形态，还应评价胃肠转化后的越橘。
结论译文：本研究证明，模拟胃肠消化显著影响Vaccinium myrtillus的植物化学组成与抗氧化性质，且果实、叶与枝间差异明显。叶与枝的酚类、黄酮与单宁一般较果实丰富，肠消化后仍保留相当量。尽管消化总体降低总植物化学含量，两种抗氧化测定响应不同：DPPH•清除活性在叶与枝提取物肠阶段后下降（由75.32–82.11%降至29.70–45.65%），而在果实提取物中升高（由约20%升至40.73–42.87%），并在胃阶段出现短暂峰值；相反，ABTS•+清除活性在多数叶与枝样品中保持较高（63.36–93.90%），在果实样品中急剧升高，M1F达95.44%、M2F达83.91%，尽管其初始活性低。这些发现提示胃肠转化可能生成或释放虽初始植物化学物减少但仍保留抗氧化活性的化合物。LC-MS/MS分析进一步证实部位间差异明显，奎宁酸与绿原酸为主要化合物，商业果实样品酚谱明显更简单。总体而言，越橘的潜在功能不能仅凭未消化植物化学组成充分评估。由于提取物为复杂混合物且消化样品未作LC-MS/MS谱学表征，所观察活性不能归于个别代谢物。此外，叶与枝的安全性、可食性与法规地位未在本研究中评价，其用于功能食品或营养保健品需先经毒理学与安全性评估。研究结果强调叶与枝除果实外亦为有前景的消化稳定植物化学物来源，并支持在评价拟用于功能食品与营养保健品的植物材料时采用胃肠消化模型。鉴于INFOGEST模型为静态体外系统且本研究应用于提取物，后续研究应：（i）消化全植物基质（鲜或干果、叶、枝）以考虑基质效应与结合态酚类；（ii）纳入人粪接种物的结肠发酵以评估未吸收酚类与单宁的归趋；（iii）采用Caco-2或Caco-2/HT29-MTX共培养等细胞吸收模型并结合细胞抗氧化测定；（iv）以非靶向高分辨质谱表征消化产物；（v）在考虑功能食品应用前于动物模型中确证生物利用度与抗氧化效应。
