流变学导向设计的可打印GelMA/Laponite生物墨水：GelMA合成工艺的影响

《Gels》：Development of Highly Printable GelMA/Laponite Bioinks by a Rheology-Guided Design Strategy: Impact of the GelMA Synthetic Procedure

　　

甲基丙烯酰化明胶（GelMA）是挤出式生物打印中应用最广泛的生物材料。然而，其固有流变学性质通常需要借助流变调节剂（如纳米黏土Laponite，Lapo）进行优化。由于GelMA/Lapo杂化生物墨水的流变行为取决于聚合物–纳米黏土相互作用，GelMA的物理化学与构象特性预计会显著影响Lapo的掺入、所得流变行为并最终影响打印性。据此，本研究将配方设计与系统的流变学导向筛选策略相结合。研究人员采用两种通过不同合成工艺获得、且具有不同物理化学与结构特性的GelMA衍生物（GelMA^DP与GelMA^SP），在生理相关条件下制备GelMA/Lapo生物墨水。与GelMA^DP相比，GelMA^SP能够均匀掺入更高含量的Lapo，拓宽了配方空间，并允许开发具有改善流变性能的杂化墨水。随后采用整合振荡温度扫描、流动扫描、屈服应力与弹性恢复分析的序贯流变学路线图，逐步筛选配方并指导适宜加工条件的选择。在所研究的配方中，SP20-3（20% w/v GelMA^SP与3% w/v Lapo）表现出最适宜的流变学特征，兼具良好的温度依赖性凝胶化、显著的剪切变稀行为与快速结构恢复，最终实现高打印保真度。这些性质在高密度细胞包载后仍基本得以保持。总体而言，这些结果确认起始GelMA的物理化学与构象特性是主导聚合物–黏土网络组织、流变行为与生物墨水打印性的关键设计参数，同时凸显了系统流变学导向方法在配方筛选与优化中的价值。

研究背景：三维（3D）挤出式生物打印（EBB）因通用性强、成本效益高且能处理多种生物材料与细胞类型，已成为组织工程与再生医学中应用最广的生物制造技术之一。EBB依赖生物墨水经喷嘴压力挤出、按计算机辅助设计（CAD）逐层沉积并经聚合物交联稳定，因而要求生物墨水同时满足支持细胞功能的生物学要求与打印过程的流变学约束。水凝胶因高含水量、可调力学性能与生化通用性而成为突出材料，但兼具生物相容性、高打印性与足够结构稳定性的配方设计仍是主要挑战。甲基丙烯酰化明胶（GelMA）因生物相容性、可降解性、低毒性及支持细胞黏附增殖的能力而备受关注，并保留明胶的热响应溶胶–凝胶转变；然而其流变行为通常不足以确保挤出后的丝条稳定性与结构恢复，故常与流变调节组分复配。合成纳米黏土Laponite（Lapo）可通过可逆颗粒间及聚合物–纳米黏土相互作用提高黏度、促进剪切变稀并稳定水凝胶网络。此类聚合物–黏土杂化体系的行为不仅取决于GelMA与Lapo浓度，还受聚合物–纳米黏土相互作用影响，而后者强烈受GelMA物理化学与构象特性及环境因素（尤其离子强度与pH）影响。更柔性的明胶链更易与纳米黏土相互作用，而其吸附于Lapo可干扰三螺旋形成。此外，离子环境可显著影响Lapo–GelMA网络组织，但含Lapo配方仍常在不能重现生理缓冲液离子环境的介质中开发优化。综上，GelMA物理化学与结构特性同生理相关条件之间的相互作用，可能是Gel–Lapo生物墨水行为的关键却认识不足的决定因素。本研究旨在探究起始GelMA的物理化学与构象特性如何影响生理相关条件下Lapo的掺入，进而影响所得配方的流变行为与打印性。研究人员选用两种由猪明胶经不同合成工艺制备的GelMA衍生物：前期工作已证明GelMA的物理化学与构象特性强烈受明胶甲基丙烯酰化合成工艺影响，其中均相单相（SP）工艺所得GelMA^SP较传统双相（DP）工艺所得GelMA^DP具有不同结构与流变特性。二者衍生化程度相当，但GelMA^SP三螺旋含量降低，呈以无规线团为主的构象，链柔性更大、分子间链–链相互作用更弱，因而凝胶化温度与黏度更低。基于此，研究人员先将两种GelMA与递增浓度Lapo复配以识别均相聚合物–黏土配方并界定配方空间，再通过系统流变学路线图对该空间进行精炼，以理性指导配方筛选、优化与选择，减少对经验性试错的依赖。研究依次开展振荡温度扫描、流动扫描、屈服应力与弹性恢复分析，评估挤出过程各阶段的流变学要求，并以每一步结果指导后续步骤，逐步缩小配方空间并确定包括挤出与打印床温度在内的最优加工条件，随后通过打印试验验证；最后将优化配方与细胞结合，考察细胞掺入后无细胞体系中确认的流变与打印性能是否得以保持。

结论与意义：本研究证明GelMA合成工艺是GelMA/Lapo墨水开发的关键设计参数，其赋予聚合物的物理化学与构象特性影响与Lapo的相互作用，进而影响聚合物–纳米黏土杂化网络组织，并体现为体系形成均相网络的能力，从而在生理相关条件下界定初始配方空间。GelMA^SP较GelMA^DP与Lapo相容性更高，可掺入更高纳米黏土浓度，提供更宽的配方空间。DPBS与超纯水中配方的显著差异表明配方介质是另一关键设计参数。在基于GelMA–Lapo相容性界定的配方空间内，通过所提出的流变学驱动方法精炼配方选择：温度扫描首先识别具有适宜热加工窗口的配方，流动扫描与屈服应力分析确认其挤出相容性，弹性恢复则提供最终区分度，基于快速近乎完全的结构恢复识别出SP20-3为最有前景的配方。打印实验验证了流变学导向选择，并表明恢复动力学密切反映墨水沉积后稳定及保持打印构造几何形状的能力。值得注意的是，最终生物墨水虽流变响应与SP20-3生物材料墨水存在微小差异（可能归因于细胞掺入和/或生物墨水制备过程），但仍保持有利的恢复与打印性能。总体而言，这些发现建立了GelMA合成、GelMA–Lapo相互作用、流变行为与打印性能之间的直接联系，支持采用序贯流变学策略理性精炼配方空间并指导EBB用GelMA/Lapo生物材料墨水与生物墨水的开发优化。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用两种合成路线制备GelMA：传统双相法（GelMA^DP）与单相法（GelMA^SP），并以¹H-NMR测定衍生化程度（DD，均为0.58 mmol/g）。以猪明胶（~300 Bloom）为原料，在DPBS（0.165 M）中制备不同浓度GelMA（5–20% w/v）与Lapo（0.5–3.0% w/v）配方，通过宏观观察与UV-Vis透光率评估均相性。采用应力控制流变仪（平行板，40 mm）依次开展振荡温度扫描（50→5 °C）、流动扫描（0.01–10,000 s^?1）、振荡应力幅度扫描（屈服应力）与三步振荡时间扫描（1%–100%–1%应变）评估弹性恢复。以气动挤出式生物打印机（22G针头）打印方形CAD模型（20×20×3 mm，7层）并经UV交联，采用ImageJ测定丝条打印性（S）、均匀性因子（U）、孔因子（Pr）与完整性因子（I）。细胞实验采用HaCaT细胞（5×10⁶ cells mL^?1）。

研究结果：（1）GelMA–Lapo配方的开发：在DPBS中，GelMA^DP仅在0.5% w/v Lapo时形成均相悬浮液，提高Lapo至1.5%或3.0% w/v时出现相分离或局部凝胶化；而GelMA^SP在所研究的全部聚合物与Lapo浓度范围内均形成均相悬浮液，表明单相合成赋予的构象特性促进生理相关条件下均相配方形成。据此选定全部SP配方及仅含0.5% w/v Lapo的DP配方进入后续流变学表征。（2）流变学导向筛选：温度扫描显示GelMA^DP的Tgel随浓度从18.3 °C升至27.5 °C，0.5% w/v Lapo使其升高；无Lapo时仅SP20出现G′–G″交叉（5.5 °C），提高Lapo浓度使GelMA^SP配方的Tgel向生理相关值移动，SP15-1.5与SP20-3的Tgel分别为32.0与34.2 °C；该步骤将24个配方缩减至6个候选（DP15、DP20、DP15-0.5、DP20-0.5、SP15-1.5、SP20-3）。流动扫描表明所有候选均呈显著剪切变稀，低剪切黏度处于10^?3–10⁴ Pa·s的适宜区间，且GelMA^SP提供更宽的流变可调性，未进一步缩减候选。屈服应力分析显示所有配方表观屈服应力均高于100 Pa，GelMA^SP体系具更高G′与网络稳定性，均满足挤出与低变形结构稳定性要求。弹性恢复分析作为最终筛选步骤显示：无Lapo的DP配方恢复最慢，Lapo改善DP体系恢复；SP15-1.5恢复显著快于DP体系；SP20-3在所有测试温度下几乎瞬时且完全恢复，成为唯一兼具快速近乎完全结构恢复、高网络刚度与适宜屈服应力的配方。（3）生物材料墨水打印性评估：打印试验表明DP基配方最佳挤出温度为Tgel+1 °C，打印床温度升高损害丝条形状保持；SP20-3在所研究温度范围内打印分辨率基本不变，与其恢复分析结果一致。定量分析显示DP20-0.5在DP基配方中性能最佳（S=1.68±0.08，U=0.91±0.05，Pr=1.13±0.07，I=0.89±0.02），但仍偏离CAD值；SP20-3则产生均匀连续丝条，S=1.09±0.02、U=1.04±0.02、Pr=1.02±0.01、I=0.99±0.01，与CAD模型高度吻合，验证了流变学筛选结果，故选定SP20-3用于后续生物墨水制备。（4）生物墨水配方与表征：将HaCaT细胞以5×10⁶ cells mL^?1高密度掺入SP20-3后，生物墨水G′、G″与屈服应力略低于无细胞墨水，且恢复的温度依赖性更强，可能反映高细胞密度对聚合物–纳米黏土网络组织的影响以及GelMA灭菌、冻干与生物墨水制备孵育条件的作用；但在挤出温度24 °C与恢复温度20 °C下仍保持快速结构恢复，打印出均匀丝条与结构完整性良好的构造，S、U、Pr、I与无细胞墨水接近，仅打印保真度轻微下降，证实优化墨水在生物墨水制备与细胞掺入后仍保持结构与打印性能。

讨论部分总结与结论翻译：本研究证明用于制备GelMA的合成工艺是GelMA/Lapo墨水开发的关键设计参数，因为所得聚合物的物理化学与构象特性影响其与Lapo的相互作用，进而影响聚合物–纳米黏土杂化网络组织。这些GelMA–Lapo相互作用差异反映在体系形成均相聚合物–纳米黏土网络的能力上，为在生理相关条件下界定初始配方空间提供了基础。在此背景下，GelMA^SP较GelMA^DP与Lapo相容性更高，能够掺入更高的纳米黏土浓度，从而为进一步优化提供更宽的配方空间。此外，DPBS与超纯水中制备的配方之间观察到的显著差异表明，配方介质是配方设计中的又一关键参数，因其可显著影响GelMA–Lapo相互作用，进而影响均相聚合物–纳米黏土网络的形成。在基于GelMA–Lapo相容性界定的配方空间内，配方选择随后通过所提出的流变学驱动方法精炼，其中每项流变学分析针对EBB不同阶段的具体要求：温度扫描分析首先识别具有适宜热加工窗口的配方，流动扫描与屈服应力分析确认其与挤出的相容性，弹性恢复则提供所选候选物之间的最终区分度，基于其快速且近乎完全的结构恢复识别出SP20-3为最有前景的配方。打印实验验证了流变学导向的选择，并表明恢复动力学密切反映墨水沉积后稳定及保持打印构造几何形状的能力。值得注意的是，尽管最终生物墨水的流变响应与SP20-3生物材料墨水相比存在微小差异（可能归因于细胞掺入和/或生物墨水制备过程），其有利的恢复与打印性能仍得以保持。总体而言，这些发现建立了GelMA合成、GelMA–Lapo相互作用、流变行为与打印性能之间的直接联系，支持采用序贯流变学策略理性精炼配方空间，并指导EBB用GelMA/Lapo生物材料墨水与生物墨水的开发与优化。