具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌与连翘坦纳菌感染对人巨噬细胞极化的差异性调控

《Cells》：Distinct Polarization of Human Macrophages in Response to Infection with the Periodontitis-Associated Bacteria Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, and Tannerella forsythia

　　

牙周健康与疾病由龈下微生物组与宿主免疫系统之间的动态相互作用所塑造，其中牙龈巨噬细胞参与组织稳态、疾病进展与炎症消退。本研究探讨了三种牙周炎相关细菌——具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与连翘坦纳菌（Tannerella forsythia）——如何在体外塑造人巨噬细胞的极化。将THP-1单核细胞分化为未极化的M0巨噬细胞，或极化为M1、M2表型，并以不同感染复数（MOI）分别感染各细菌。通过CD80（M1）与CD209（M2）的表面表达以及多重检测法测定的促炎与抗炎细胞因子产生来评估极化。对牙龈卟啉单胞菌的应答与另两种菌显著不同。牙龈卟啉单胞菌抑制M1与M2极化，并降低多种促炎与抗炎细胞因子水平。相反，具核梭杆菌与连翘坦纳菌增强M1巨噬细胞中CD80表达与促炎细胞因子产生，并适度增加M2巨噬细胞中的促炎介质。这些发现提示牙龈卟啉单胞菌作为颠覆先天免疫应答的基石病原体（keystone pathogen）具有独特作用，而具核梭杆菌与连翘坦纳菌则作为牙周致病共生菌（pathobionts）发挥作用。

牙周炎是一种高发的牙齿支持组织慢性炎症性疾病，可破坏牙周组织并导致牙齿丧失，其病因复杂，普遍认为由龈下微生物群与宿主免疫系统之间共生关系被破坏所致的菌群失调（dysbiosis）驱动。长期以来，“红复合体”（red complex，由牙龈卟啉单胞菌、连翘坦纳菌与齿垢密螺旋体组成）被视为牙周炎的主要病因，而新一代测序揭示了健康与疾病状态下结构迥异的复杂龈下微生物群，故牙周炎现被视为由复杂微生物群落驱动的多微生物感染，众多成员作为致病共生菌在菌群失调时触发或放大炎症。巨噬细胞是参与吞噬、抗原提呈、胞葬作用、炎症消退与组织再生的先天免疫细胞，具有高度异质性，可大致分为促炎M1表型（高表达CD80并分泌TNF-α、IFN-γ、IL-6）与抗炎M2表型（表达CD209并产生高水平IL-10与精氨酸酶），且具有高度可塑性。以往关于牙周炎相关细菌对巨噬细胞极化影响的研究多集中于牙龈卟啉单胞菌，而具核梭杆菌与连翘坦纳菌，尤其在人源细胞中的研究甚少，各菌对巨噬细胞极化的影响尚未完全明确。基于此，研究人员以人单核细胞系THP-1为模型，将细胞分化为未极化M0巨噬细胞并以不同MOI感染各菌，同时在极化至M1或M2表型的过程中同步感染，通过特征性表面标志物表达与特征性细胞因子产生评估极化，旨在明确三种牙周炎相关菌对人巨噬细胞极化的影响。研究得出明确结论：在所有测试条件下，巨噬细胞对牙龈卟啉单胞菌的应答均不同于具核梭杆菌与连翘坦纳菌——前者抑制M1与M2相关极化并降低细胞因子产生，符合其作为颠覆先天免疫的基石病原体的角色；后两者则放大促炎应答并驱动巨噬细胞向M1相关表型偏移，与其作为放大炎症的牙周致病共生菌的角色一致。这些物种特异性应答为龈下群落各成员如何促成牙周炎所涉及的宿主-微生物组失衡提供了机制性见解，并可能为恢复免疫稳态的策略提供参考。

研究人员采用的主要关键技术方法为：以佛波酯（PMA）处理THP-1单核细胞72 h并静息24 h使其分化为M0巨噬细胞，分别以IFN-γ联合大肠杆菌脂多糖（LPS）或IL-4联合IL-13诱导M1或M2极化；以不同MOI的具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌与连翘坦纳菌感染M0、M1、M2巨噬细胞48 h；以流式细胞术（以CD36确认巨噬细胞分化，以可固定活力染料FVD eFluor780评估活力，以CD80与CD209评估极化表型）分析表面标志物与活力；以LEGENDplex多重检测法测定培养上清中促炎与抗炎细胞因子浓度。研究所用菌株为连翘坦纳菌ATCC 43037、具核梭杆菌 subsp. nucleatum KP-F8（OMZ598）与牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277。

研究结果如下。3.1 细菌感染对THP-1巨噬细胞活力的影响：通过流式细胞术检测CD36⁺FVD^?事件比例发现，M0巨噬细胞感染三种细菌均致活细胞比例轻度下降且种间无差异；M1巨噬细胞中仅具核梭杆菌在MOI 500时显著降低活力；M2巨噬细胞中感染对活力无影响。3.2 细菌感染对M0巨噬细胞特征性表面标志物表达与细胞因子产生的影响：通过流式细胞术与多重检测法发现，三种细菌均浓度依赖性增加CD80⁺巨噬细胞比例，但仅具核梭杆菌与连翘坦纳菌达统计学显著且显著高于同等MOI的牙龈卟啉单胞菌；CD209⁺比例无显著变化；具核梭杆菌与连翘坦纳菌总体增加M1特征性细胞因子（IL-1β、IL-6、IP-10达显著），牙龈卟啉单胞菌显著降低IP-10且总体诱导作用较低；具核梭杆菌与连翘坦纳菌增加IL-10，牙龈卟啉单胞菌对所受测细胞因子均无显著影响。3.3 细菌感染对M1巨噬细胞特征性表面标志物表达与细胞因子产生的影响：具核梭杆菌与连翘坦纳菌在MOI 50与100增加CD80⁺比例，而牙龈卟啉单胞菌降低该比例；CD209⁺比例无显著变化；具核梭杆菌与连翘坦纳菌增加多数M1特征性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-12p40、IL-12p70），牙龈卟啉单胞菌显著增加IL-1β、IFN-γ与IL-23、显著降低IP-10，且除IFN-γ外各细胞因子水平均显著低于另两种菌；具核梭杆菌与连翘坦纳菌增加IL-4、IL-10与TARC，牙龈卟啉单胞菌在多数MOI显著降低精氨酸酶、TARC与IL-1Ra。3.4 细菌感染对M2巨噬细胞特征性表面标志物表达与细胞因子产生的影响：三种细菌均增加CD80⁺比例，但牙龈卟啉单胞菌的增幅显著较小；具核梭杆菌与连翘坦纳菌显著增加而牙龈卟啉单胞菌显著降低CD209⁺比例；具核梭杆菌显著增加TNF-α与IL-6、连翘坦纳菌显著增加IL-6，而牙龈卟啉单胞菌降低所有M1特征性细胞因子；具核梭杆菌与连翘坦纳菌增加IL-4、IL-10与TARC，牙龈卟啉单胞菌在多数MOI降低精氨酸酶、TARC与IL-1Ra并于MOI 25轻度增加IL-10。

讨论部分总结：研究显示除具核梭杆菌在M1极化中MOI 500外，感染一般不影响巨噬细胞活力（该条件下仍有逾80%巨噬细胞存活），此轻度下降可能与感染本身及高水平IL-1β（可触发多种细胞凋亡）有关，而IL-1β升高亦可能部分源于细胞死亡伴有的IL-1β释放；牙龈卟啉单胞菌与连翘坦纳菌对活力无实质影响，与既往报道的差异可能反映巨噬细胞来源与实验方案不同，且牙龈卟啉单胞菌的促凋亡活性具有细胞类型特异性。在M0巨噬细胞中，具核梭杆菌与连翘坦纳菌增强M1相关应答且两者间无质的差异，而牙龈卟啉单胞菌仅引起弱激活。在M1相关极化中，具核梭杆菌与连翘坦纳菌进一步提高CD80⁺比例并增强除IFN-γ外几乎所有促炎细胞因子产生，同时增加IL-4、IL-10与TARC等抗炎细胞因子；牙龈卟啉单胞菌则降低CD80⁺比例、仅弱诱导促炎细胞因子并抑制抗炎细胞因子产生，此减弱的M1相关应答与近期报道其经蛋白酶与细胞外囊泡抑制THP-1巨噬细胞IFN-γ诱导应答相符。IFN-γ因被用于诱导M1极化，其水平解读需谨慎，但牙龈卟啉单胞菌在最低MOI 25进一步增加IFN-γ、更高MOI则递减，同时由IFN-γ驱动的IP-10在所有MOI均被显著降低，提示其即便在低MOI增加IFN-γ产生亦抑制下游IFN-γ信号，此双重效应的意义尚不明确，而IFN-γ失活可能进一步促成免疫颠覆与菌群失调。在M2相关极化中，三种细菌均增加CD80⁺比例但牙龈卟啉单胞菌作用最弱，且仅其降低CD209⁺比例；牙龈卟啉单胞菌降低所有促炎细胞因子并降低IL-4、精氨酸酶与TARC（IL-4降至数pg/mL可能反映蛋白酶降解），另两种菌则维持或增加抗炎细胞因子；具核梭杆菌与连翘坦纳菌感染后促炎与抗炎细胞因子同时增加及CD80⁺与CD209⁺比例同时升高，凸显严格M1/M2分类的局限，此类应答可能反映伴随调节性反馈的炎症激活（如IL-10限制炎症而非指示独立的M2极化程序），亦可能反映巨噬细胞群体的异质性，支持巨噬细胞活化是情境依赖、相互重叠的应答谱而非离散极化状态的观点。综合而言，牙龈卟啉单胞菌抑制THP-1巨噬细胞的M2相关极化，而具核梭杆菌与连翘坦纳菌轻度增强之同时使细胞向M1相关表型偏移。研究指出牙龈卟啉单胞菌的独特行为可能源于其颠覆宿主应答的多种机制及牙龈蛋白酶对宿主细胞因子的蛋白水解降解；抑制M1极化可能削弱清除入侵病原体与控制感染所需的促炎应答，抑制M2极化则可能损害炎症消退并延迟组织再生，这些效应与其作为龈下微生物群落基石病原体的角色完全一致；具核梭杆菌与连翘坦纳菌引起的促炎刺激与既往报道及其作为放大炎症、促进菌群失调的致病共生菌角色相符。研究人员提出，牙龈卟啉单胞菌通过巨噬细胞破坏病原体清除、炎症消退与组织再生，而具核梭杆菌与连翘坦纳菌在活动性疾病期间加剧炎症。研究的主要局限在于体外模型：THP-1细胞不能完全再现牙龈组织驻留巨噬细胞，诱导极化不能完全再现体内巨噬细胞状态谱，表型表征每种极化条件仅依赖单一表面标志物，细菌于极化期间加入使研究无法区分对极化相关特征发育的影响与对巨噬细胞应答的同期调控，单一菌株的单种感染不能捕捉龈下多物种生物膜-宿主相互作用或菌株依赖性变异，未评估48 h时细菌活力，且细胞因子测定仅限于培养上清而未行mRNA分析或细胞因子降解直接分析，故无法区分细胞产生变化与潜在蛋白水解效应；未来需采用原代人巨噬细胞、扩展的表型表征及含多种菌株的多物种生物膜模型加以确认与拓展。

研究结论部分翻译：研究结果表明，牙周炎相关细菌对人巨噬细胞极化发挥显著不同的效应。牙龈卟啉单胞菌抑制M1与M2相关极化并削弱细胞因子产生，符合其作为颠覆先天免疫应答、从而损害病原体清除、炎症消退与组织修复的基石病原体的角色。相反，具核梭杆菌与连翘坦纳菌放大促炎应答并驱动巨噬细胞向M1相关表型偏移，与其作为加剧炎症的牙周致病共生菌的角色一致。这些物种特异性应答为龈下群落各成员如何促成牙周炎所涉及的宿主-微生物组失衡提供了机制性见解，并可能为旨在恢复免疫稳态的策略提供参考。