《Cells》：Recipient Cell Type-Dependent Association of Extracellular Vesicles from Different Cellular Origins
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细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是颇具前景的治疗性递送纳米载体；然而，影响其与受体细胞相互作用的因素仍未被完全阐明。本研究利用来源于HEK293T、SKBR-3和Yummer细胞的mNG-CD81标记EVs，考察了受体细胞特
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是颇具前景的治疗性递送纳米载体；然而，影响其与受体细胞相互作用的因素仍未被完全阐明。本研究利用来源于HEK293T、SKBR-3和Yummer细胞的mNG-CD81标记EVs，考察了受体细胞特异性的EV关联。在与人类上皮细胞、免疫细胞及小鼠黑色素瘤细胞系于不同剂量和时间点孵育后，通过流式细胞术评估EV相关荧光。观察到受体细胞类型之间存在显著差异。在人上皮细胞中，肝来源的Huh7和HepG2细胞表现出最高比例的荧光阳性细胞，而亲本HEK293T细胞则最低。THP-1细胞表现出高于Jurkat细胞的EV相关荧光，而Yummer黑色素瘤细胞在暴露于HEK293T来源EVs后表现出高于B16F10细胞的荧光。使用SKBR-3和Yummer来源EVs也观察到类似的受体细胞模式。值得注意的是，Yummer细胞与其自身EVs表现出相对较高的关联，表明低亲本细胞关联并非普遍现象。EV相关荧光通常随剂量和孵育时间增加而升高。尽管这些发现凸显了受体细胞特异性，但EV供体来源与受体细胞特征的相对贡献仍未解决。此外，流式细胞术无法区分表面关联与内化的EVs。总之，这些发现确定受体细胞特异性是EV相关荧光的重要决定因素，为理解EV–细胞相互作用提供了基础，并为靶向EV递送策略的开发提供信息。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为治疗性递送纳米载体的应用前景广阔，但其与受体细胞相互作用的决定因素尚未完全阐明。本研究旨在系统比较不同来源EVs与多种受体细胞类型之间的关联差异，以明确受体细胞身份是否为影响EV关联的主要因素。既往研究多强调EV供体来源的靶向特异性，但不断积累的证据提示受体细胞特性（如膜受体表达、脂质组成、细胞骨架组织及代谢活性）可能在EV摄取效率中起主导作用；然而，缺乏在标准化条件下对多供体—多受体组合进行系统比较的研究。为此，研究人员通过慢病毒转导构建稳定表达CD81-mNeonGreen（mNG）融合蛋白的HEK293T、SKBR-3和Yummer供体细胞系，在无血清条件下收集条件培养基，经切向流过滤、超滤及尺寸排阻色谱（SEC）纯化EVs，并利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、成像流式细胞术和Western blot进行表征。随后将荧光标记EVs与人类上皮细胞（HEK293T、SKBR-3、Caco-2、PDAK、HepG2、Huh7）、免疫细胞（THP-1、Jurkat）及小鼠黑色素瘤细胞（B16F10、Yummer）孵育，通过流式细胞术评估EV相关荧光。研究结论表明，EV相关荧光在受体细胞类型间存在显著差异，肝来源Huh7和HepG2细胞及THP-1细胞表现出较高关联，而亲本HEK293T和SKBR-3细胞关联较低；Yummer细胞与其自身来源EVs关联较高，说明低亲本细胞关联并非普遍现象；EV相关荧光一般随剂量和孵育时间增加。该研究将受体细胞特异性确定为EV关联的重要决定因素，为理解EV–细胞相互作用及开发靶向EV递送策略奠定了基础，但供体来源与受体细胞特征的相对贡献及表面关联与内化的区分仍有待进一步研究。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：构建编码人源或鼠源CD81与mNeonGreen（mNG）融合蛋白的慢病毒载体并转导供体细胞以获得稳定表达荧光标记EVs的细胞系；采用切向流过滤、超滤和尺寸排阻色谱（SEC）分离纯化EVs；通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、成像流式细胞术和Western blot对EVs进行粒径、形态、表面标志物（CD81）及腔内蛋白（TSG101）表征；以流式细胞术定量检测受体细胞在2 h和4 h、不同EV剂量下的EV相关荧光；采用双因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较进行统计检验。所用细胞系均购自ATCC，未涉及临床样本队列。
研究结果如下：3.1 EVs表征：通过NTA显示分离EVs模态粒径为125–135 nm，TEM证实囊泡完整呈球形膜结合结构，成像流式细胞术显示超过94%囊泡CD81阳性，Western blot证实TSG101存在，表明SEC成功分离出符合EV特征的囊泡。3.2 HEK293T来源EVs与人上皮细胞系的关联评估：肝来源Huh7细胞在2 h时荧光阳性比例最高（90%–98.5%），HepG2次之，PDAK较低，亲本HEK293T最低（0.6%–16.5%）；4 h时各细胞比例普遍升高，Huh7接近100%。3.3 HEK293T来源EVs与人免疫细胞系的关联评估：THP-1细胞荧光阳性比例最高（2 h时10.33%–80.3%，4 h时23.8%–84.7%），Jurkat次之，HEK293T最低；Jurkat在高剂量下两时间点变化不大。3.4 HEK293T来源EVs与小鼠黑色素瘤细胞系的关联评估：Yummer细胞荧光阳性比例高于B16F10和HEK293T细胞，趋势在两个时间点一致，且随EV浓度增加而升高。3.5 SKBR-3来源EVs与人上皮细胞系的关联评估：Huh7和HepG2细胞荧光阳性比例最高，超过产EV的SKBR-3细胞；PDAK和Caco-2随剂量和时间增加而升高；HEK293T低于多数细胞系，但4 h时显著高于SKBR-3细胞；整体模式与HEK293T来源EVs一致。3.6 Yummer来源EVs与小鼠黑色素瘤细胞系的关联评估：Yummer细胞荧光阳性比例显著高于B16F10细胞，表明低亲本细胞关联并非普遍现象；Yummer来源EVs与人受体细胞系的关联模式与HEK293T、SKBR-3来源EVs broadly相似。上述结果表明受体细胞身份与EV相关荧光差异相关，但供体来源与受体细胞特征的相对贡献尚未解决。
讨论部分总结：研究人员指出EV相关荧光反映的是细胞关联荧光而非确认的内化；Huh7和HepG2的高关联可能与细胞内吞活性有关但机制未直接研究；亲本HEK293T低关联提示共享细胞来源不一定导致高关联；THP-1高关联可能与其单核细胞谱系的颗粒识别和内吞机制有关但未证实具体通路；Yummer与自身EVs高关联及B16F10低关联提示供体–受体相互作用可能影响关联。剂量和时间依赖性升高在各细胞系中一致，但部分高剂量下平台现象可能反映检测阈值而非饱和。研究局限性包括：流式细胞术无法区分表面结合与内化；受体细胞特异性机制未直接研究；供体–受体组合不平衡；mNG-CD81稳定表达可能影响EV生物发生和膜组成且未与未修饰EVs直接比较；实验仅限体外；未评估功能性货物递送和治疗疗效。
研究结论翻译：本研究凸显受体细胞特异性是EV–细胞相互作用的关键特征，证明人上皮细胞、免疫细胞及小鼠黑色素瘤细胞系之间EV相关荧光存在显著差异。Huh7、HepG2和THP-1细胞通常表现出较高的EV相关荧光，而亲本HEK293T和SKBR-3细胞与其各自EVs的关联相对较低。相反，Yummer细胞与Yummer来源EVs的关联高于B16F10细胞，表明低亲本细胞关联并非普遍现象。不同EV供体来源间类似受体细胞模式的重复出现进一步支持受体细胞身份在塑造EV关联中的重要性，尽管供体与受体细胞特征的相对贡献仍未解决。EV相关荧光一般随剂量和孵育时间增加。重要的是，这些测量无法区分表面关联与内化，也无法确定功能性货物递送。总之，这些发现强调在设计基于EV的递送策略时考虑受体细胞特异性的重要性。仍需进一步研究其潜在机制、EV内化、功能性货物递送及体内行为以确立其治疗相关性。
