姜黄素衍生物J147通过抑制CHOP并经由不依赖ATP5A的机制保护HT22细胞抵抗衣霉素诱导的内质网应激性细胞死亡

《Cells》：Curcumin-Derived J147 Protects HT22 Cells from Cell Death Under Tunicamycin-Induced Endoplasmic Reticulum Stress with CHOP Suppression Retained After ATP5A Knockdown

　　

氧化应激与蛋白毒性内质网（ER）应激是参与神经元损伤的相互关联的细胞应激过程。据报道，J147通过ATP合酶α亚基（ATP5A）相关的线粒体机制发挥神经保护作用，但其是否通过相同机制保护细胞抵抗蛋白毒性ER应激下的死亡尚不清楚。本研究在小鼠海马HT22细胞中，直接比较了姜黄素、CNB-001和J147在谷氨酸（Glu）诱导的氧化性死亡（oxytosis）和衣霉素（TM）诱导的ER应激下的作用。MTT还原实验显示，三种化合物均能减轻Glu诱导的细胞死亡，而仅J147在亚微摩尔浓度范围内保护细胞抵抗TM诱导的细胞毒性。LIVE/DEAD染色证实了J147对两种应激源的保护作用。在分子水平上，J147在mRNA和蛋白水平抑制了TM诱导的促凋亡转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）的上调，而未抑制适应性ER伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的诱导。ATP5A敲低减轻了Glu诱导的氧化性死亡，但未保护细胞抵抗TM诱导的细胞死亡，且J147在ATP5A敲低后仍保留其保护作用。这些发现支持J147具有应激源依赖性的保护作用，即针对氧化应激涉及ATP5A相关机制，而针对蛋白毒性ER应激则涉及与抑制CHOP诱导相关的ATP5A非依赖机制。因此，J147可能为研究神经元对相互关联的氧化应激和蛋白毒性应激的反应提供有用的药理学工具。

神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）以进行性神经元功能障碍和丢失为特征，多种细胞应激通路汇聚促进神经退行性变。其中，氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质稳态受损和内质网（ER）应激是密切关联的神经元损伤 contributory 因素。神经元因高代谢需求、复杂形态以及对ER在蛋白质折叠、脂质合成、钙调节和细胞内运输方面的高度依赖，对ER稳态紊乱尤为脆弱。ER中未折叠或错误折叠蛋白的过度积累激活未折叠蛋白反应（UPR），这是一个促进蛋白质稳态恢复的适应性信号网络。然而，过度或持续的ER应激使UPR从适应性反应转变为促死亡程序，最终导致神经元细胞死亡。这些发现凸显了适应不良的ER应激信号作为神经元保护的有前景的药理学靶点。

ER应激诱导细胞死亡的关键介质是C/EBP同源蛋白（CHOP），一种在适应不良UPR信号下游被诱导的促凋亡转录因子。CHOP在ER应激诱导细胞死亡中的因果作用已通过CHOP缺陷细胞对ER应激敏感性降低所证实。CHOP通过下调抗凋亡因子并在严重ER应激下促进凋亡信号级联而参与神经元脆弱性。其表达在主要神经退行性疾病（包括AD、PD和ALS）的尸检脑组织和实验模型中强烈上调。此外，抑制CHOP激活可减轻缺氧诱导损伤模型中的神经元细胞死亡。这些研究支持过度CHOP激活在多种病理背景下对神经元丢失的重要贡献。因此，选择性靶向这一CHOP相关的适应不良ER应激通路是神经保护的一种潜在策略。

姜黄素是一种源自姜黄的 polyphenolic 化合物，已在神经退行性变实验模型中被广泛研究其神经保护、抗氧化和抗炎作用。姜黄素通过减少上游氧化应激来减轻缺氧诱导的ER应激和CHOP表达。然而，其治疗潜力受限于化学稳定性差、水溶性低和脑生物利用度受限。姜黄素衍生的神经保护化合物如CNB-001和J147已被开发以提高效力和药理学性质。J147表现出强效的神经营养和神经保护特性，并改善脑衰老和AD动物模型的认知功能。临床前研究还证明了J147良好的生物利用度和安全性特征，支持其作为神经系统疾病候选治疗药物的进一步开发。ATP5A，即线粒体ATP合酶的α亚基，已被确定为J147的分子靶点，并被认为参与其对线粒体代谢的影响和对氧化应激的保护作用。由于线粒体功能、细胞内Ca²⁺稳态和ER蛋白质稳态密切关联，ATP5A相关信号可能影响细胞对ER应激的反应。最近一项体内研究表明，J147在创伤性脑损伤后减弱皮层神经元中ER应激相关信号。然而，ATP5A与CHOP诱导之间的直接调控关系尚未建立，且J147介导的细胞保护及直接蛋白毒性应激下CHOP诱导的减少是否需要ATP5A仍不清楚。

小鼠海马HT22细胞系是一种源自小鼠海马培养物的永生化神经元细胞系，表现出神经元样功能性胆碱能特性。HT22细胞中的分子细胞死亡通路在Glu诱导的氧化性细胞死亡（oxytosis）和TM诱导的ER应激敏感性方面与初级神经元高度相似。在该模型中，细胞外Glu抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运体系统x_c^?，从而减少胱氨酸摄取和谷胱甘肽合成，促进ROS积累和氧化性细胞死亡。相反，TM抑制N-连接糖基化，导致错误折叠蛋白在ER中积累并激活UPR。持续的UPR信号可诱导CHOP并促进细胞死亡。因此，这两种模型通过不同的主要机制启动细胞损伤——Glu模型中的氧化还原失衡和TM模型中的ER蛋白质稳态破坏——从而允许在不同应激条件下比较J147的作用。因此，HT22细胞是比較候选神经保护化合物对 distinct 但相互关联的神经元应激通路作用的 useful 平台。重要的是，使用单一细胞背景能够直接比较对Glu诱导的氧化性死亡和TM诱导的蛋白毒性ER应激的药理学反应，同时最小化细胞类型依赖性变异。在本研究中，研究人员旨在比较姜黄素、CNB-001和J147对HT22细胞中Glu诱导的氧化性细胞死亡和TM诱导的ER应激介导的细胞死亡的作用。研究人员进一步检验了J147介导的细胞保护和TM暴露下CHOP诱导的减少在ATP5A敲低后是否保留。该设计使研究人员能够检验J147是否参与独立于其已建立的ATP5A相关线粒体作用的额外保护成分。在此，研究人员证明J147通过独立于其已建立的ATP5A相关线粒体作用的ATP5A非依赖机制保护HT22细胞抵抗化学诱导的蛋白毒性ER应激。这些发现为研究J147如何调节对不同氧化应激和蛋白毒性应激条件的反应提供了细胞框架。

在技术方法方面，研究人员使用小鼠海马HT22细胞系（由Salk研究所已故David Schubert教授提供），通过MTT还原实验评估细胞活力，采用相衬显微镜观察形态学变化，利用LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒（calcein-AM和EthD-1）定量活/死细胞，通过实时定量PCR（qPCR）检测Ddit3（编码CHOP）mRNA表达，采用蛋白质印迹分析CHOP、GRP78和ATP5A蛋白水平，使用ATP5A特异性siRNA进行基因敲低，并通过GraphPad Prism进行EC₅₀计算和统计分析。

研究结果如下：

3.1 姜黄素、CNB-001和J147保护HT22细胞抵抗Glu诱导的氧化性细胞死亡：通过MTT还原实验和形态学观察，发现三种化合物均以浓度依赖方式减轻Glu诱导的细胞毒性，但J147在低至0.1 μM即显著保护，效力高于姜黄素和CNB-001。

3.2 J147选择性保护HT22细胞抵抗TM诱导的ER应激下的细胞死亡：通过MTT实验和形态学观察，发现仅J147在低至0.1 μM显著保护细胞抵抗TM诱导的细胞毒性，姜黄素和CNB-001无效。

3.3 浓度-反应分析表明J147具有更强的保护效力：通过非线性回归计算EC₅₀，在Glu模型中J147的EC₅₀为0.0327 μM，CNB-001为1.60 μM，姜黄素>10 μM；在TM模型中J147的EC₅₀为0.259 μM，CNB-001>10 μM，姜黄素无法确定。

3.4 J147减少氧化和ER应激条件下的EthD-1阳性死细胞：通过LIVE/DEAD染色，发现2.5 μM J147显著减少Glu和TM诱导的EthD-1阳性死细胞比例。

3.5 J147抑制TM诱导的CHOP表达而不降低GRP78诱导：通过qPCR和蛋白质印迹，发现J147显著抑制TM诱导的Ddit3 mRNA和CHOP蛋白上调，而姜黄素和CNB-001无此作用；TM诱导的GRP78蛋白表达在J147存在下仍然明显。

3.6 J147在ATP5A敲低后仍保留TM诱导ER应激下的保护作用：通过siRNA敲低ATP5A，发现ATP5A敲低减轻Glu诱导的氧化性细胞死亡，但不保护抵抗TM诱导的细胞毒性；J147在对照和ATP5A敲低细胞中均增加TM暴露下的细胞活力，并同样抑制TM诱导的CHOP蛋白表达。

讨论部分总结：本研究比较了姜黄素及其衍生物CNB-001和J147对HT22细胞中Glu诱导的氧化性死亡和TM诱导的ER应激的保护作用。尽管三种化合物均减轻Glu诱导的氧化性细胞死亡，但仅J147保护细胞抵抗TM诱导的ER应激下的死亡。这种保护伴随Ddit3/CHOP诱导的减少，而TM诱导的GRP78表达在J147存在下仍然明显。ATP5A敲低重现了针对氧化损伤的保护表型，但既未阻止TM诱导的细胞毒性，也未消除J147的保护作用。这些发现支持对氧化应激和TM诱导应激至少部分不同的保护反应，Glu模型中为ATP5A相关保护，TM暴露下为ATP5A非依赖保护并伴随CHOP诱导减少。J147最初通过基于姜黄素的表型筛选程序鉴定，旨在克服姜黄素的药理学局限性。J147在Glu诱导的氧化性死亡模型中显示的EC₅₀比CNB-001低约50倍。J147还保护HT22细胞抵抗TM诱导的ER应激条件下的细胞死亡，而姜黄素或CNB-001未表现此效应。J147在本研究中观察到的关键特征是在TM诱导的ER应激期间优先抑制CHOP诱导。然而，由于本研究未对CHOP进行遗传操作，这些发现不能确定CHOP表达减少介导J147诱导的细胞保护。重要的是，J147未抑制TM诱导的GRP78表达。J147通过靶向ATP5A调节线粒体功能、细胞能量代谢和氧化应激。与先前模型一致，本研究证实ATP5A敲低减轻HT22细胞中Glu诱导的氧化性细胞死亡。相反，ATP5A敲低未保护HT22细胞抵抗TM诱导的细胞毒性，表明仅ATP5A抑制不足以 prevent 化学诱导的蛋白毒性ER应激诱导的细胞死亡。这些发现支持J147对TM诱导的蛋白毒性ER应激的保护作用包含ATP5A非依赖成分的解释。本研究存在一定局限性：HT22细胞是永生化增殖细胞，不能完全重现成熟有丝分裂后海马神经元的生物学特性；J147减少CHOP诱导与细胞保护平行，但本研究证明的是关联而非因果关系；未研究参与J147相关CHOP表达减少的上游UPR通路；ATP5A参与仅使用单一siRNA评估；TM是本研究使用的唯一药理学ER应激诱导剂。

结论部分翻译：总之，J147（而非姜黄素或CNB-001）保护HT22海马神经元细胞抵抗TM诱导的ER应激相关细胞死亡。这种保护作用伴随CHOP诱导的抑制而不降低GRP78表达，并在ATP5A敲低细胞中保留。相反，ATP5A敲低减轻Glu诱导的氧化性细胞损伤，而未减轻TM诱导的细胞毒性。这些发现支持J147对氧化应激和ER应激诱导的细胞毒性的保护作用存在至少部分不同的机制。在Glu诱导的氧化性死亡模型中，J147相关保护与ATP5A相关机制有关。在TM暴露下，J147介导的保护在ATP5A敲低后保留，并与CHOP诱导减少平行发生。进一步阐明J147介导保护的这一ATP5A非依赖成分可能为细胞应激反应的调控提供新见解。