基于Au@MnOx纳米酶类氧化酶活性的无H2O2比色传感平台构建及马拉硫磷高灵敏检测研究

《Foods》：Colorimetric Sensor Based on the Oxidase-like Activity of Au@MnOx Nanozyme for High-Sensitivity Detection of Malathion

　　

基于Au@MnOx纳米酶类氧化酶活性的比色传感器用于马拉硫磷高灵敏度检测

摘要：有机磷农药残留严重威胁农产品。因此，探索针对目标物灵敏、高效的分析检测方法具有重要意义。研究人员合成了一种荔枝状金核-氧化锰壳层结构（Au@MnOx），该结构表现出显著的类氧化酶（OXD）活性。其能够在无需过氧化氢（H₂O₂）的条件下催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色产物（oxTMB）。马拉硫磷能够抑制酸性磷酸酶（ACP）活性，减少L-抗坏血酸（AA）的生成，削弱颜色猝灭效应，并使体系恢复蓝色。基于这一“信号抑制-恢复”模式，研究人员构建了比色传感器，并将其应用于食品基质中马拉硫磷的定量分析，检测限（LOD）为1.51 ng/mL。黄瓜和白菜样品中马拉硫磷的平均回收率范围分别为97.2%–104.5%和99.4%–102.5%，所有相对标准偏差（RSDs）均小于7%。该研究为马拉硫磷提供了一种灵敏、高效的比色检测策略，在食品安全领域具有重要的应用价值。

有机磷农药（OPs）作为全球广泛应用的化合物，在控制作物病害、虫害及杂草方面发挥关键作用。然而，其实际生产与使用并未严格遵守相关法规，导致农产品与生态环境中残留过量。这些残留农药经食物链进入人体后，可损害免疫系统与内分泌系统，甚至诱发癌症；同时可不可逆抑制胆碱酯酶活性，造成乙酰胆碱积累，干扰神经系统正常调节功能，对健康构成严重威胁。此外，农药进入水体、土壤等环境还会破坏生态平衡与生物多样性。因此，开发灵敏、可靠、快速的农药残留检测方法，是保障食品安全与维护生态环境的迫切需求。传统仪器检测方法虽具备较高精度，但存在仪器昂贵、维护成本高、检测周期长、样品前处理复杂及需专业人员操作等不足，难以在基层现场普及。近年来，纳米酶作为一类可在纳米尺度模拟天然酶催化活性的新型功能材料，因其高稳定性、强兼容性与多酶活性模拟能力，在生物医学检测、农产品质量安全及环境监测等领域展现出广阔前景。比色法凭借直观可视的结果与高度便携性，非常适合现场快速检测。将纳米酶与比色法结合，兼具操作简便、响应迅速、成本低廉且无需大型设备的优势，极有利于便携式传感器开发。基于此，研究人员开展本研究，旨在利用新型纳米酶构建高效比色传感平台，实现食品中马拉硫磷的高灵敏检测。

在本研究中，研究人员成功制备了一种具有荔枝状形貌的金核-氧化锰壳层结构纳米材料（Au@MnOx），并证实其具有优异的类氧化酶（OXD）样活性。该材料能够在无过氧化氢（H₂O₂）参与条件下，通过直接电子转移驱动3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化生成蓝色产物（oxTMB）。同时，酸性磷酸酶（ACP）可特异性水解L-抗坏血酸-2-磷酸酯（AA2P）生成L-抗坏血酸（AA），AA能有效还原oxTMB导致体系褪色。当马拉硫磷存在时，其抑制ACP活性，减少AA生成，削弱颜色猝灭效应，使体系恢复蓝色，建立652 nm处吸收信号的增强响应。基于这一“信号抑制-恢复”机制，研究人员构建了Au@MnOx/TMB/ACP/AA2P比色传感平台。结果表明，该平台可在40 min内完成检测，对马拉硫磷的检测限（LOD）低至1.51 ng/mL，显著低于GB 2763-2026规定的黄瓜与白菜中最大残留限量（MRLs）。黄瓜与白菜加标回收实验验证了方法的准确性，相对标准偏差（RSDs）均低于7%。该研究为食品安全领域马拉硫磷的定量检测提供了新的技术路径，在快速筛查与现场检测方面展现出重要的应用潜力。

在关键技术方法方面，研究人员采用一步共还原-共沉淀法合成Au@MnOx，以酒石酸（TA）为还原剂，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为稳定剂。借助透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）与傅里叶变换红外光谱（FTIR）对材料形貌、结构、元素组成及表面化学态进行系统表征。通过稳态动力学实验与Lineweaver-Burk双倒数作图计算米氏常数（K_m）与最大反应速率（V_max），评价类氧化酶动力学性能；结合活性氧物种（ROS）捕获实验与细胞色素C（Cyt C）电子受体探针，验证其非自由基直接电子转移催化机制。实际样品检测以购自滁州某超市的黄瓜与空白白菜为加标样本，经匀浆、乙腈提取、活性炭吸附色素、离心、0.22 μm聚醚砜（PES）滤膜过滤及氮吹复溶前处理后进行比色测定。

**Au@MnOx的合成与表征**
TEM显示Au@MnOx呈良好分散的荔枝状形貌，平均粒径约86 nm，具有清晰核壳结构；高分辨TEM测得晶格条纹间距0.235 nm，对应Au的(111)晶面。XRD证实Au为面心立方（FCC）结构，MnOx可能以无定形状态存在。XPS显示Au以单质Au⁰形式存在，Mn表面以Mn²⁺、Mn³⁺与Mn⁴⁺混合价态共存。FTIR在约510 cm^?1处出现Mn-O键特征吸收，进一步确认材料组成。

**Au@MnOx的催化活性与动力学**
底物筛选表明TMB为最优显色底物，Au@MnOx催化TMB氧化后在652 nm处呈现最强吸收峰。H₂O₂依赖实验与除氧实验证明，该催化过程既不依赖外加H₂O₂，也不依赖溶解氧（O₂），其催化能力源于材料固有的氧化还原性质。

**Au@MnOx的催化机制与性能**
ROS捕获实验表明，对苯醌（BQ）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、L-组氨酸（L-His）与异丙醇（IPA）均未显著抑制催化活性，提示反应遵循非自由基途径。Cyt C探针实验证实Au@MnOx可通过直接电子转移获取电子，多价锰物种参与电子传递。稳态动力学测得K_m为0.146 mM，V_max为10.95 × 10^?8 M·s^?1，表明该材料具有较强的底物亲和力与良好的催化效率。30天储存稳定性实验表明Au@MnOx保持稳定的类氧化酶活性。

**检测探针的构建**
Au@MnOx催化TMB生成蓝色oxTMB，建立652 nm处特征吸收信号；ACP水解AA2P生成AA，有效还原oxTMB导致褪色。马拉硫磷存在时抑制ACP活性，减少AA生成，颜色猝灭效应减弱，体系蓝色恢复，652 nm处吸收增强，验证了“信号抑制-恢复”机制的可行性。

**探针检测条件优化**
经系统优化，确定最适孵育时间为20 min；酸性磷酸酶（ACP）最佳工作浓度为100 U/L；AA2P在5 mg/mL时水解产物足以完全还原oxTMB。三平行实验的变异系数（CV）均低于15%，表明方法重现性良好。

**探针分析性能**
体系在652 nm处的吸收强度随马拉硫磷浓度升高而增强，呈现两段线性关系：0–0.5 μg/mL范围内线性方程为y = (0.497 ± 0.019)x + (0.125 ± 0.005)（R² = 0.993），0.5–3.0 μg/mL范围内为y = (0.217 ± 0.011)x + (0.290 ± 0.017)（R² = 0.990）。根据3σ/S法计算，检测限（LOD）为1.51 ng/mL，与已有方法相比线性范围更宽、检测限更低。

**特异性及抗干扰能力**
常见无机离子及其他有机磷农药未引起体系明显响应，表明探针对马拉硫磷具有良好选择性。但原文指出该系统的分子识别与抗干扰深层机制仍有待进一步阐明。

**实际样品中马拉硫磷分析**
黄瓜和白菜加标回收实验显示，马拉硫磷平均回收率分别在97.2%–104.5%与99.4%–102.5%之间，相对标准偏差（RSDs）均小于7%，未见显著基质干扰，可准确定量马拉硫磷残留。

讨论与结论部分指出，研究人员成功合成的Au@MnOx兼具优异OXD样活性与长期稳定性。所构建的Au@MnOx/TMB/ACP/AA2P无H₂O₂比色传感平台，利用ACP特异性水解产物AA与oxTMB之间的氧化还原竞争，结合马拉硫磷对ACP的抑制作用，建立了由AA与马拉硫磷协同调控的“信号抑制-恢复”策略。该方法仅需简单紫外-可见（UV-vis）光学测量，无需大型仪器，40 min内完成分析，LOD低至1.51 ng/mL，优于已有文献报道。实际样品分析证实该探针具备满意的精密度与回收率。综上所述，该技术在食品安全领域展现出快速、灵敏检测马拉硫磷的潜力，为农产品中马拉硫磷残留的现场筛查与准确定量提供了可靠的技术方案。