超声辅助天然深共熔溶剂提取谷子多酚：对秀丽隐杆线虫氧化应激的缓解作用及多组学机制解析

《Foods》：Ultrasound-Assisted Natural Deep Eutectic Solvent Extraction of Millet Polyphenols: Alleviating Effects on Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans and Omics Analysis

　　

谷子多酚富含营养物质，具有抗氧化、抗菌和降血糖活性，但其体内作用机制尚不清楚。本研究采用三元天然深共熔溶剂（NADES）作为传统溶剂的绿色替代品，应用超声辅助提取优化纯化谷子多酚提取物。以秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为体内模型评估抗氧化活性。研究人员测定了生长发育、运动能力、寿命和抗氧化酶活性，结合转录组RNA测序（RNA-seq）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和非靶向代谢组学来探索潜在的调控机制。结果表明，纯化的谷子多酚提取物改善了应激状态下线虫的生长、发育和运动能力，并延长了寿命。它们提高了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，降低了丙二醛（MDA）水平。转录组学和代谢组学结果表明，纯化的谷子多酚提取物的抗氧化作用可能与Wnt、PI3K-Akt和P53/P21信号通路的变化相关。同时，代谢物水平（如甘油磷脂代谢和嘌呤代谢）的重塑也表明它可能通过多通路网络发挥保护作用。然而，这些通路是否被激活并在保护效应中发挥因果作用仍需要功能实验验证。

许多疾病的发生与人体内的氧自由基有关，其中羟基自由基等高反应性自由基不仅攻击神经细胞线粒体导致细胞损伤，还可造成DNA分子破坏。多酚类化合物凭借其结构中的酚羟基团能够有效打断氢原子与自由基的结合，从而清除自由基。大量研究已阐明葡萄籽、绿茶和石榴等植物多酚的抗氧化潜力。谷子作为我国最早种植的主要谷物之一，富含膳食纤维、蛋白质、淀粉、维生素以及游离和结合酚酸、黄酮、黄烷醇、异黄酮和少量单宁等活性成分，在预防或减缓骨质疏松、癌症、糖尿病、神经及心血管疾病等退行性疾病方面具有重要作用。然而，关于谷子多酚的体内抗氧化机制仍缺乏系统性研究。为此，研究人员以谷子为原料，建立并优化了绿色提取工艺，制备纯化多酚提取物，利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）氧化应激模型，系统分析其对线虫生理表型、转录水平及代谢轮廓的影响。研究发现纯化谷子多酚提取物能够显著改善氧化应激下线虫的生长发育与运动能力，延长寿命，增强超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，并降低丙二醛（MDA）水平。转录组与代谢组联合分析提示，其保护作用可能与Wnt、PI3K-Akt、P53/P21、FoxO及mTOR等多条信号通路的变化以及甘油磷脂、嘌呤、色氨酸等代谢网络的重塑相关。该研究为谷子功能食品的开发及抗氧化天然活性成分的高值化利用提供了初步科学依据。

在开展研究过程中，研究人员首先筛选并优化了三元天然深共熔溶剂（NADES，一种绿色溶剂）配方及超声辅助提取参数，采用大孔树脂吸附纯化获得谷子多酚提取物。随后以尿嘧啶缺陷型大肠杆菌（E. coli OP50）饲养的野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans，一种常用模式生物）为体内模型，设置正常对照、H₂O₂诱导氧化应激模型及不同浓度多酚处理组。通过测定线虫体长、体宽、运动行为、寿命及抗氧化酶/非酶指标评估生理效应；利用转录组测序（RNA-seq，一种高通量转录本分析技术）结合实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR，用于精确定量基因表达的技术）分析基因表达变化；采用基于超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q Exactive HF-X）的非靶向代谢组学技术解析代谢轮廓，并通过主成分分析（PCA，一种多元统计降维方法）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，一种有监督的判别分析模型）及京都基因与基因组百科全书（KEGG，整合生物通路信息的数据库）通路富集进行多组学整合分析。

3.1 多酚对线虫体长和体宽的影响
研究人员通过测量不同处理组线虫形态指标发现，H₂O₂抑制了线虫体长和体宽，与正常组相比分别下降9.12%和12.25%。纯化多酚处理可不同程度缓解这种发育抑制，其中低剂量组体长增加7.34%，中剂量组体长增加4.76%、体宽增加9.3%，高剂量组体长增加7.0%、体宽增加8.81%，提示多酚能够减轻氧化应激对线虫生长发育的不良影响。

3.2 多酚对线虫运动行为的影响
运动能力测试表明，与正常组相比，模型组线虫身体弯曲频率显著下降21.91%。纯化多酚干预后，低、中、高剂量组身体弯曲频率分别较模型组提升11.94%、18.71%和12.9%。头摆频率在各组间无统计学显著差异，但高剂量组较模型组呈7.59%的数值上升趋势。结果表明纯化谷子多酚提取物对H₂O₂诱导的运动行为缺陷具有缓解作用。

3.3 多酚对线虫寿命的影响
寿命实验显示，空白对照组平均寿命为17.54天，而模型组因H₂O₂胁迫显著缩短至12.5天。与模型组相比，纯化多酚处理组中剂量组平均寿命延长最显著，达15.80天，最大寿命24天；高剂量组平均寿命15.66天，最大寿命26天；低剂量组平均寿命14.47天。Log-rank趋势检验未显示显著的线性剂量依赖关系（p = 0.5914），提示寿命延长效应可能呈现非单调性剂量反应，但中剂量组在整体指标上表现出相对最优的干预潜力。

3.4 多酚对线虫抗氧化应激能力的影响
急性氧化应激存活实验表明，与空白组相比，纯化多酚低、中、高剂量组在0.1% H₂O₂环境中的平均存活时间分别延长10.86%、18.24%和11.09%，证实该提取物具有明确的抵抗H₂O₂胁迫的能力，能够通过降低线虫氧化应激水平提高其存活率。

3.5 多酚对H₂O₂诱导氧化应激相关酶的影响
酶活测定结果显示，模型组过氧化氢酶（CAT）活性较正常组显著下降，而纯化多酚低、中、高剂量组可使CAT活性分别恢复70.90%、92.69%和68.78%。模型组超氧化物歧化酶（SOD）活性较正常组代偿性升高52.28%，多酚处理后SOD活性较模型组进一步增加19.92%、31.15%和5.24%。同时，模型组丙二醛（MDA）含量显著升高，而多酚处理可分别降低9.46%、21.9%和26.53%。研究人员指出，模型组中SOD活性升高而CAT活性降低可能反映抗氧化防御系统失衡，H₂O₂过量累积导致CAT更易发生氧化失活；多酚处理可显著恢复CAT活性，有助于维持抗氧化系统平衡并抑制脂质过氧化损伤。

3.6 氧化应激模型的建立
通过浓度梯度实验，研究人员确定1000 μM H₂O₂处理48小时可显著增加线虫MDA含量而不影响其存活率，据此建立稳定的氧化应激模型，为后续多酚干预实验提供基础。

3.7 谷子多酚对线虫转录组的影响
转录组测序质量控制显示RNA纯度高、测序质量值Q20 > 98%、Q30 > 95%，满足分析要求。主成分分析（PCA）显示对照组、模型组和中剂量多酚组样本明显分离，证实氧化应激与多酚干预显著改变了线虫的基因表达谱。差异基因分析表明，模型组与对照组仅检测到141个差异表达基因，而中剂量多酚组与模型组相比差异表达基因高达3001个（上调2282个，下调719个），提示多酚触发了广泛的转录级联反应。基因本体（GO，一个描述基因产物属性的国际标准分类系统）功能注释显示差异基因显著富集于“response to oxidative stress”等生物过程及“antioxidant activity”等分子功能。KEGG通路分析发现差异基因映射到Wnt、PI3K-Akt、P53/P21、cGMP-PKG、Hippo、mTOR及FoxO等多条信号通路。具体而言，糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）上调可能通过促进β-catenin降解复合物组装抑制Wnt/β-catenin信号过度激活；PI3K-Akt通路中Akt可通过磷酸化Caspase-9阻断凋亡级联；P53/P21通路参与细胞周期阻滞调控。关键基因验证显示，cyp-35A2、skpo-3和ZK1025.8表达显著上调，eya-1和phat-5表达显著下调，与RNA-seq数据趋势完全一致。Wang et al. (2014)发现敲低eya-1可显著降低线虫对高温和氧化胁迫的耐受性，并在氧化胁迫下缩短平均寿命18.7%，本研究证实eya-1是线虫抗逆的关键因子，可能作为多酚影响氧化应激抗性的潜在靶点。Jin et al. (2011)证实utx-1敲除或杂合突变可延长线虫寿命并增加H₃K₂₇me₃整体水平；Maures et al. (2011)进一步揭示utx-1通过去除胰岛素/IGF-1信号通路关键基因daf-2上的H₃K₂₇me₃抑制性修饰调控寿命，本研究推测utx-1可能与多酚延长氧化应激下线虫寿命的作用相关。Offenburger et al. (2018)报道glit-1和tsp-17处于同一遗传通路，两者突变体对6-OHDA和百草枯诱导的氧化损伤均表现非累加性高敏表型，本研究发现tsp-17显著下调可能以反馈方式参与氧化损伤调控。研究人员特别指出，cyp-35A2属于CYP35细胞色素P450亚家族，其上调可能增强机体氧化应激主动防御。

3.8 谷子多酚对线虫代谢组的影响
基于超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q Exactive HF-X）的非靶向代谢组学在7次交叉验证基础上表明模型稳定可靠，对照组、模型组与中剂量多酚组代谢轮廓显著分离。与模型组相比，中剂量多酚组鉴定出716个候选差异代谢物（上调491个，下调225个），上调比例较高，提示多酚可能主动诱导保护代谢通路激活。差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、ABC转运体、色氨酸代谢及药物代谢-细胞色素P450等通路。其中，15个候选差异代谢物参与甘油磷脂代谢，Cheng et al. (2016)发现肿瘤细胞中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺等甘油磷脂合成常上调以满足快速增殖需求；Li et al. (2023)证实核苷酸酵母水解物可通过调节甘油磷脂代谢延长线虫寿命并增强抗氧化能力，本研究提示多酚可能参与调整膜脂组成或信号脂质代谢。嘌呤代谢方面，13个相关代谢物（如腺苷、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤）变化显著，Tian et al. (2022)研究了嘌呤代谢基因对哺乳动物氧化应激适应的进化影响；Liu et al. (2024)证明栝楼果提取物通过抗氧化和调节嘌呤代谢发挥线虫抗衰老作用，本研究整体上调趋势提示机体可能增强补救途径或尿酸合成以提升内源性抗氧化缓冲能力。ABC转运体底物（如腺苷、纤维二糖、核黄素等）协同上调，Villa et al. (2024)和Grewal et al. (2017)分别综述了ABC转运体在神经退行性疾病和癫痫耐药中的重要作用，本研究提示多酚可能强化该家族介导的解毒与抗氧化保护网络。色氨酸代谢中5-甲氧基色胺和L-色氨酸增加，吲哚-3-乙酰胺降低，Xue et al. (2023)系统阐述了色氨酸代谢在健康与疾病中的多重角色；Kaur et al. (2019)通过计算机模拟分析了肠道菌群对色氨酸代谢及肠-脑轴的影响，本研究推测多酚可能通过调控该通路抑制炎症和减轻氧化损伤。此外，Zhang et al. (2023)指出琥珀酸可作为信号分子参与氧化应激和炎症调控；Shiels et al. (2020)发现胆绿素及其还原产物胆红素磺酸盐能抑制单钠尿酸盐诱导的无菌性炎症，本研究提示琥珀酸、喹啉酸和胆绿素等变化表明提取物可能从能量代谢和抗氧化防御两个维度影响线虫氧化还原稳态。

讨论部分
研究人员指出，与以往研究多聚焦单一通路不同，Chen et al. (2013)报道花青素可能通过激活DAF-16/FOXO转录因子延长紫色小麦中线虫寿命；Li et al. (2023)发现黑米花青素提取物通过激活胰岛素/IGF-1信号通路改善PC12细胞抗氧化能力并延长线虫寿命。Zhu et al. (2024)报道发酵红米可改善多酚的抗氧化活性、生物可及性和降血脂活性；Zhao et al. (2020)发现植物乳杆菌dy-1发酵的大麦提取物通过daf-2依赖机制减少秀丽隐杆线虫脂肪积累。不同于这些主要关注单通路或代谢的研究，本研究发现纯化谷子多酚的抗氧化效应涉及Wnt、PI3K-Akt和p53/p21等多条通路，同时伴随甘油磷脂和嘌呤代谢的重塑，呈现出多通路协同调控与代谢重塑特征。结合绿色提取工艺，该发现为谷子多酚作为高价值天然功能配料的开发提供了初步科学线索。然而，研究人员也强调了本研究的局限性：未设置单独的NADES空白对照及单组分对照，无法完全排除溶剂本身的影响；组学分析仅采用总体表型最优的中剂量组，未能充分表征剂量依赖效应；关键代谢物未以真实标准品验证，鉴定结果属于MSI Level 2推定注释。最重要的是，尚未开展基因敲低、突变株筛选或通路抑制剂等功能实验，因此富集的Wnt、PI3K-Akt、p53/p21及FoxO等通路仅为提示性候选机制，其激活状态及因果作用尚不能确立。

研究结论
本研究成功建立了超声辅助天然深共熔溶剂提取纯化谷子多酚的工艺，并在秀丽隐杆线虫模型中证实纯化谷子多酚提取物能改善H₂O₂诱导的氧化应激损伤，表现为生长发育与运动能力改善、寿命延长、SOD与CAT活性升高及MDA水平降低。转录组与代谢组整合分析提示，其作用机制可能与Wnt、PI3K-Akt、P53/P21、FoxO及mTOR等信号通路及甘油磷脂、嘌呤、色氨酸等代谢网络的重塑相关，但上述通路和代谢物的具体因果作用仍需通过基因敲低、突变株等体内功能实验进一步验证。