噬菌体JXAU-SA-P1通过直接裂解病原菌及缓解宿主炎症反应保护小鼠金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎

《Foods》：Phage Administration Protects Against Staphylococcus aureus-Induced Mastitis Through Direct Pathogen Lysis and Subsequent Alleviation of Host Inflammatory Responses in a Murine Model

　　

摘要 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）诱导的乳腺炎对全球乳制品行业和生乳安全构成严重威胁。本研究旨在评估本实验室近期分离的裂解性噬菌体JXAU-SA-P1对小鼠S. aureus诱导乳腺炎的保护作用，并阐明其潜在机制。研究人员将42只泌乳期BALB/c小鼠（产后7–10天）分为七组（n = 6），以评估乳腺内S. aureus攻毒后的细菌载量减少、组织病理学变化及宿主免疫应答。结果表明，JXAU-SA-P1显著降低了S. aureus载量并减轻了乳腺组织病理学损伤，其疗效优于抗生素治疗。安全性评估显示，在缺乏宿主细菌的情况下，JXAU-SA-P1被稳定清除，且未触发炎症反应。转录组学分析鉴定出448个由高剂量噬菌体给药调控的共同差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示，噬菌体给药抑制了主要促炎信号通路，包括TNF、NF-kappa B和IL-17信号通路。通过蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析，鉴定出核心调控枢纽基因，包括IL-1β、Ptprc、Itgam、Fcgr3和Itgb2。随后的ELISA实验证实，促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）、中性粒细胞浸润标志物髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）以及血清免疫球蛋白（IgA、IgM和IgG）均显著降低。综上所述，噬菌体JXAU-SA-P1通过直接裂解病原菌及随后的宿主炎症反应缓解，有效减轻了乳腺炎，为开发基于噬菌体的产品作为乳制品生产中安全、无抗生素的生物防治制剂提供了坚实的实验基础。

一、研究背景与意义

乳腺炎是全球乳制品行业最具破坏性的疾病之一，不仅导致产奶量显著下降，还严重损害乳成分、加工品质和奶牛生产力，造成巨大的经济损失。大多数乳腺炎病例由病原微生物引起，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是主要的接触性传染性病原体。S. aureus主要通过挤奶过程中的接触传播，经乳头管进入乳腺实质。该病原体分泌多种强效毒力因子，包括溶血素、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）和杀白细胞素等。这些耐热毒素在生乳中的持续存在可导致严重的食源性中毒，直接威胁消费者健康。

历史上，基于抗生素的化学疗法一直是乳腺炎治疗的一线方案。然而，抗生素的广泛过度使用加速了抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的出现和传播，并导致治疗失败率增加。此外，乳腺内抗生素给药可导致生乳中抗生素残留污染，强制休药期和由此产生的散装乳处理给乳制品生产者带来额外经济负担。从食品加工角度看，残留抗生素可抑制干酪和酸奶发酵过程中乳酸菌发酵剂活力，同时可能破坏消费者肠道菌群稳态并促进耐药基因的水平转移。因此，亟需开发替代性抗菌策略。

噬菌体（bacteriophages, phages）是特异性感染并高效裂解细菌的病毒。与抗生素相比，噬菌体具有自我复制能力、高特异性、强裂解效率、对正常菌群干扰小、与细菌宿主共同进化以及分布广泛等优势。大量体外研究已证实其强大的杀菌活性和清除生物被膜的能力。然而，大多数现有研究主要聚焦于病原体清除，噬菌体如何调节宿主转录稳态并抑制感染乳腺组织中破坏性的细胞因子风暴，其精确机制仍不清楚。

二、研究内容与结论

本研究利用泌乳期小鼠乳腺炎模型，系统评估了本实验室前期分离的噬菌体JXAU-SA-P1对S. aureus诱导乳腺炎的治疗效果和转录组调控机制。研究发现，乳腺内局部给予JXAU-SA-P1可显著降低S. aureus载量并减轻炎症诱导的组织病理学损伤。在安全性方面，相同剂量条件下，噬菌体对照组的小鼠乳腺组织中噬菌体滴度显著低于S. aureus + H-Phage组，表明在S. aureus存在时，噬菌体通过宿主依赖性复制维持增强的局部持久性，持续维持高局部滴度以促进细菌减少；而在未感染的噬菌体对照组中，病毒颗粒被迅速从乳腺组织清除。进一步分析显示，噬菌体对照组与PBS对照组在组织炎症和病理损伤方面无差异，且转录组分析仅检测到8个差异表达基因，表明JXAU-SA-P1本身在体内不触发炎症反应。

S. aureus感染改变了宿主乳腺的转录稳态。研究人员在PBS对照组与S. aureus组之间鉴定出2135个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），这些基因主要参与免疫系统过程、信号受体活性、TNF信号通路和趋化因子信号通路，表明病原体感染激活了乳腺的先天免疫和过度炎症反应。值得注意的是，高剂量噬菌体治疗逆转了448个感染应答基因，其免疫调节谱比抗生素治疗（逆转222个基因）更广泛、更复杂。KEGG富集分析显示，这448个重叠DEGs显著富集于多个免疫和炎症相关通路。同时，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）结果表明，S. aureus感染后激活的某些通路在JXAU-SA-P1给药后被抑制，包括S. aureus感染、TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-kappa B信号通路和NOD样受体信号通路。研究人员推测，JXAU-SA-P1快速裂解S. aureus，减少了病原体相关分子模式的过度激活，这种继发效应降低了炎症级联反应的过度激活并解决了转录风暴。

通过蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析，研究人员鉴定出多个核心调控枢纽基因，包括IL-1β、Ptprc、Itgam、Fcgr3和Itgb2，并通过RT-qPCR进行了验证。Itgam和Itgb2编码Mac-1整合素复合物的亚基，该复合物是中性粒细胞黏附的关键介质并诱导促炎细胞因子分泌。这些分子的下调证实了乳腺内给予噬菌体JXAU-SA-P1可调节宿主先天应答并减轻炎症反应，这与组织病理学切片中观察到的大量炎症细胞浸润消失以及髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性显著降低一致。

ELISA分析证实，TNF-α、IL-6和IL-1β作为关键促炎细胞因子，其表达在JXAU-SA-P1给药后显著下调。此外，S. aureus感染可能损伤乳腺的血乳屏障，使细菌抗原进入血液并触发强烈的全身免疫应答。本研究中，S. aureus组血清IgA、IgG和IgM水平较高，表明机体产生较强的免疫应答以清除病原体；而高剂量噬菌体治疗逆转了这种反应，有效减弱了病原体诱导的早期全身激活。高剂量噬菌体治疗将这些标志物维持在未感染基线水平的能力，凸显了其在快速清除局部病原体、保持组织完整性和预防全身炎症方面的有效性。

从更广泛的食品安全角度来看，在农业和兽医领域应用基于噬菌体的生物防治制剂对于确保供人类消费的肉、蛋和奶的安全与质量至关重要。已有研究表明，从污水处理站回收的大肠杆菌噬菌体能有效减少污染肉类上的细菌数量和生物被膜形成；污水来源的沙门氏菌噬菌体可用于治疗鸡沙门氏菌病和食品直接净化；污水分离的荧光假单胞菌噬菌体表达的内溶素LysPFX32在鲜猪肉保鲜中表现出抗菌功效。这些研究共同强调了环境来源噬菌体作为安全、无抗生素干预措施的潜力，以改善动物健康并确保整个生产链的食品安全。

三、关键技术方法

研究人员建立了泌乳期BALB/c小鼠乳腺炎模型，通过乳腺内灌注S. aureus（5 × 10⁸ CFU/mL）攻毒，感染后4小时通过相同途径给予治疗制剂，包括PBS、0.1%头孢噻呋钠（50 μg/腺体）以及三个递增滴度（5 × 10⁶、5 × 10⁷、5 × 10⁸ PFU/mL）的噬菌体JXAU-SA-P1。主要技术方法包括：细菌载量和噬菌体滴度定量（Baird-Parker琼脂平板计数法和双层琼脂法）；组织病理学评估和苏木精-伊红（H&E）染色及病变评分；Illumina NovaSeq X Plus平台转录组测序（RNA-seq），数据经fastp质控、HISAT2比对至Mus musculus参考基因组（GRCm39）、StringTie组装定量；DESeq2鉴定差异表达基因（|log₂FoldChange| > 2，FDR < 0.05）；GO功能注释和KEGG通路富集分析；基因集富集分析（GSEA）；STRING数据库和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络；RT-qPCR验证枢纽基因表达；ELISA定量检测血清和乳腺组织中的细胞因子、MPO及免疫球蛋白水平。

四、研究结论

噬菌体JXAU-SA-P1显著降低了S. aureus载量并减轻了S. aureus感染诱导的乳腺组织病理学损伤。转录组测序在S. aureus组与S. aureus + H-Phage组之间鉴定出448个重叠差异表达基因。基因集富集分析显示，噬菌体给药通过继发于细菌减少的作用抑制了主要促炎信号通路。此外，RT-qPCR和ELISA验证均证实，给予噬菌体JXAU-SA-P1通过消除主要炎症刺激物，减轻了全身炎症反应和先天免疫激活。更重要的是，噬菌体JXAU-SA-P1的安全性已在炎症、组织病理学和转录组学水平得到证实。