基于非靶向代谢组学的三个金柑品种果皮与果肉代谢特征及黄酮类成分差异分析

《Foods》：Metabolic Characteristics and Flavonoid Differences in Peel and Flesh of Three Kumquat Cultivars Based on Non-Targeted Metabolomics

　　

研究人员采用基于超高效液相色谱-串联质谱（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS）的非靶向代谢组学（Non-Targeted Metabolomics）方法，探究了三个融安金柑品种果皮和果肉组织的代谢物差异。研究共检测到5043种代谢物。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示不同品种间的代谢谱存在明显分离。以变量重要性投影（Variable Importance in Projection, VIP）> 1且|Log2FC| ≥ 1.0为阈值筛选显著改变的代谢物。研究共注释了193种黄酮类代谢物，其中84种黄酮（flavones）和28种黄酮醇（flavonols）是优势亚类。黄酮谱表现出显著的品种和組織特異性差异。Huapi kumquat（HP）和Cuimi kumquat（CM）表现出組織特異性的花青素（anthocyanins）积累，花青素主要在果皮组织中富集，而Youpi kumquat（YP）则积累大量查尔酮（chalcones）和二氢黄酮（flavanones）。果皮组织中的黄酮代谢变异大于果肉组织。2′,6′-二羟基-4,4′-二甲氧基查尔酮（log2FC高达8.44）和啤酒花素（xanthohumol）被鉴定为候选代谢标志物。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析进一步揭示了不同的组织偏向性代谢特征。具体而言，果皮中与品种相关的代谢变异与二萜（diterpenoid）和脂质代谢通路相关，而果肉代谢差异则与吲哚生物碱（indole alkaloid）生物合成、组氨酸（histidine）代谢和叶酸（folate）生物合成相关。该研究系统阐明了三个金柑品种果皮和果肉的代谢特征及黄酮差异，为金柑种质资源的评价与利用提供了候选代谢标志物和理论支持。

金柑（Fortunella crassifolia Swingle）是芸香科金柑属植物，其果皮与果肉均可食用，富含维生素、矿物质、有机酸及黄酮、酚酸等次生代谢物，具有开胃、理气、止咳、化痰之效，其果实提取物亦表现出抗氧化、抗炎等生理功能。近年来，柑橘类果实代谢组学研究虽已成为热点，但相较于其他柑橘品种，金柑的相关研究仍相对匮乏。现有工作多集中于“滑皮”（Huapi）和“油皮”（Youpi），而“脆蜜”（Cuimi）金柑的代谢特征，特别是果皮与果肉组织的代谢差异，尚未得到系统阐明。融安地区金柑种植历史逾300年，是中国金柑核心生产基地，“脆蜜”作为第三代品种，是通过人工选育自“滑皮”的自然芽变而来。为解析不同品种金柑的代谢特征差异，为深加工与定向育种提供理论依据，研究人员开展了此项研究。

研究人员以融安三个主栽品种“油皮”（Youpi, YP）、“滑皮”（Huapi, HP）和“脆蜜”（Cuimi, CM）成熟果实为试材，对其果皮和果肉进行非靶向代谢组学分析，旨在系统阐明三个品种组织特异性代谢差异，重点解析黄酮类化合物的组成、分布及代谢通路特征，筛选差异代谢标志物。该研究为金柑种质资源评价、品质改良及高营养价值品种选育提供了理论支撑和候选标志物。

研究人员综合运用了多项关键技术：首先采用基于超高效液相色谱-串联质谱（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS）的非靶向代谢组学平台，在信息依赖采集（Information-Dependent Acquisition, IDA）模式下正负离子分别检测；通过主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）与正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA）进行多变量统计建模；依据代谢组学标准倡议（Metabolomics Standards Initiative, MSI）进行代谢物注释；并采用基于超几何检验的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析筛选关键通路。样本队列来源于中国广西壮族自治区柳州市融安县一处商业果园的三个金柑品种，每品种随机采集至少三株生长势一致果树的外围果实，每树40余个完整健康果，混合后分离果皮与果肉，各设置三个生物学重复，液氮速冻后保存于?80 °C。

多变量统计分析
研究人员共检测到5043个代谢特征，涵盖氨基酸及其衍生物、有机酸、苯类和取代衍生物、生物碱、黄酮、醇类和胺类、杂环化合物、甘油磷脂（Glycerophospholipids, GP）、酚酸、核苷酸及其衍生物、萜类、木脂素和香豆素、脂质、脂肪酰（Fatty Acyls, FA）、甘油酯（Glycerolipids, GL）、类固醇、醌类、鞘脂（Sphingolipids, SL）、色胺、胆碱和色素、单宁及其他674种代谢物。依据MSI分级，1170个特征归为Level 2，3873个为Level 3。PCA显示，不同品种及组织间代谢谱显著分离，QC样本居中，重复样本紧密聚集，YP与另两个品种差异明显，而HP与CM表现一定相似性。

显著改变代谢物的鉴定
OPLS-DA模型显示，各比较组R2Y均为1且Q2 > 0.85，200次置换检验p < 0.005，模型稳定可靠。以VIP > 1且|Log2FC| ≥ 1.0为阈值，六个比较组分别筛选出1895、2065、972、1502、2085和1393个显著改变代谢物，表明果皮与果肉在不同品种间均存在广泛的代谢重塑。

黄酮的差异积累
研究共注释193种黄酮代谢物，其中黄酮（flavones，84种）和黄酮醇（flavonols，28种）为优势亚类，主要单体为山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李吡喃糖苷和牡荆素2″-O-鼠李糖苷。黄酮谱呈显著品种和组织特异性差异。HP和CM表现为组织特异性花青素积累，主要富集于果皮；YP则积累大量查尔酮和二氢黄酮。HPP vs. YPP中，73种黄酮差异积累，6种花青素均在HPP上调，2′,6′-二羟基-4,4′-二甲氧基查尔酮log2FC高达8.44；CMP vs. YPP中，74种黄酮差异积累，5种花青素在CMP上调，该查尔酮log2FC为8.38；HPF vs. YPF中，YP中异黄酮、二氢黄酮及多数查尔酮更丰富；CMF vs. YPF中，78种黄酮差异积累，4种花青素在CMF上调，该查尔酮log2FC为7.25。总体上，果皮差异积累黄酮多于果肉；HP与CM黄酮模式相近，与YP分歧显著；2′,6′-二羟基-4,4′-二甲氧基查尔酮在HP和CM的果皮与果肉中均高积累，而多种查尔酮优先在YP积累。

三个金柑品种的KEGG富集分析
KEGG分析揭示了组织偏向性代谢特征。果皮中，HPP vs. YPP与CMP vs. YPP的品种相关变异主要关联二萜（diterpenoid）生物合成及脂质代谢；CMP vs. HPP中甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid Metabolism）富集程度最高。果肉中，HPF vs. YPF主要富集于吲哚生物碱（indole alkaloid）生物合成；CMF vs. YPF关联组氨酸（histidine）代谢；CMF vs. HPF则与叶酸（folate）生物合成关联最紧密，其中分支酸、二氢叶酸、墨蝶呤和7,8-二氢甲蝶呤在CMF均低积累。

讨论与结论
讨论部分指出，本研究发现的黄酮以黄酮和黄酮醇为主，与Kawaii et al.对柑橘属植物的黄酮定量研究及Cho et al.对金柑果皮化学成分的鉴定结果相符。果皮比果肉含更多差异积累黄酮，表明果皮是黄酮积累的主要部位。鉴于CM源自HP人工选育，二者黄酮谱相似而与YP差异显著。在代谢流层面，查尔酮是黄酮生物合成的入口，柚皮素查尔酮在查尔酮合酶（Chalcone Synthase, CHS）催化下生成；二氢黄酮醇作为关键分支点，受黄酮醇合酶（Flavonol Synthase, FLS）、二氢黄酮醇4-还原酶（Dihydroflavonol 4-Reductase, DFR）等调控向黄酮醇或花青素分流。YP中多种查尔酮积累提示其代谢流偏向查尔酮保留与二氢黄酮形成，而HP和CM则更多将资源分配给果皮花青素生成。

研究结论部分表明：研究人员利用UPLC-MS/MS非靶向代谢组学表征了三个融安金柑品种果皮与果肉的代谢谱，共检测5043种代谢物，注释193种黄酮（以黄酮和黄酮醇为主）。果皮差异积累黄酮多于果肉；HP与CM（果皮和果肉）黄酮模式相似，与YP存在显著代谢分歧。查尔酮2′,6′-二羟基-4,4′-二甲氧基查尔酮在HP和CM组织（果皮和果肉）中均高度积累，而其他多种查尔酮优先在YP积累。KEGG富集分析表明，果皮品种变异关联二萜和脂质通路，果肉代谢差异则与吲哚生物碱、组氨酸和叶酸生物合成相关。该研究揭示了金柑品种与组织间的黄酮代谢差异，为种质资源筛选和品质改良提供了理论支持。