DHHC21介导的回肠ASBT S-酰化与n-3多不饱和脂肪酸（EPA）非S-酰化直接结合对胆汁酸转运的差异调控

《International Journal of Molecular Sciences》：Differential Modulation of the Ileal Bile Acid Transporter ASBT by Fatty Acids

　　

回肠顶端钠依赖性胆汁酸转运体（ASBT）是胆汁酸与胆固醇稳态的关键介导者，并通过S-酰化受脂肪酸调控。本研究探讨了饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸对ASBT差异调控的机制。利用在ASBT羧基端（C-terminus）连接含CAAX盒的异戊烯化（prenylation）模拟构建体，研究人员发现转染HEK293细胞的转运活性显著升高，提示饱和脂肪酸的直接连接可刺激ASBT功能。此外，siRNA介导的DHHC21酰基转移酶（acyltransferase）表达减弱降低了ASBT的S-酰化及其功能，证明DHHC21是ASBT功能的正向调控因子。相反，omega-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）如二十碳五烯酸（EPA）处理降低了HEK293细胞中ASBT的功能。向喂饲高脂高胆固醇饮食的C57BL6/J小鼠补充作为n-3 PUFAs来源的鱼油，可保护其免受饮食诱导的肝脂肪变性，同时胆汁酸吸收减少，与ASBT受抑制相一致。这得到以下结果支持：粪便胆汁酸增加、回肠胆汁酸刺激基因表达降低、肝脏胆汁酸合成相关基因表达增加。HEK293细胞中炔基-EPA（alkyne-EPA）代谢标记首次显示该n-3 PUFA与ASBT的直接结合。与棕榈酸（palmitate）修饰不同，EPA结合对羟胺（hydroxylamine）洗脱具有高度抗性，表明其机制不同于S-酰化。研究数据揭示了DHHC21调控ASBT的新作用，并为饱和棕榈酸与多不饱和EPA以不同机制结合ASBT提供了证据。对ASBT的直接作用及对胆汁酸吸收的抑制可能部分促成n-3 PUFAs对肝脏的保护作用。

研究背景方面，回肠顶端钠依赖性胆汁酸转运体（ASBT）介导回肠胆汁酸重吸收的限速步骤，维持胆汁酸在小肠与肝脏之间的循环，胆汁酸对乳化脂质、促进其吸收至关重要。既往研究显示不同胆汁酸种类对脂肪酸吸收具有差异效应，总胆汁酸池减少会降低饱和脂肪酸而非不饱和脂肪酸的吸收；ASBT功能降低可显著缩小胆汁酸池并改变胆汁酸组成，因此改变ASBT也可能对脂肪酸吸收产生差异影响。鉴于ASBT在维持胆汁酸稳态和影响脂质吸收中的核心作用，其已被广泛研究作为代谢性及脂质和胆固醇相关疾病的治疗靶点：抑制ASBT可降低血浆胆固醇、改善2型糖尿病血糖控制、并对饮食诱导的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）具有保护作用，但结果存在差异，提示存在尚未阐明的调控因素。小鼠模型研究显示，ASBT抑制剂预防MASLD的疗效随饮食中富集脂肪酸类型而异，富含饱和脂肪酸饮食下ASBT介导的代谢功能障碍改善作用强于富含多不饱和脂肪酸饮食。机制上，既往研究证明脂肪酸通过S-酰化对ASBT产生翻译后效应，该可逆修饰通过硫酯键使脂肪酸直接结合多肽中的半胱氨酸残基，改变蛋白功能、构象及在特定质膜结构域中的定位；ASBT在不同细胞系及天然小鼠和人肠道中均存在基础水平的S-酰化，S-酰化抑制剂可降低ASBT活性。催化蛋白S-酰化的酰基转移酶家族已鉴定出23种同工酶（DHHC1-24），含保守的Asp-His-His-Cys（DHHC）结构域并具有独特的组织与亚细胞分布，但参与ASBT S-酰化的DHHC酶尚不清楚。ASBT活性可被饱和脂肪酸（如棕榈酸）增强、被单不饱和脂肪酸（如油酸）降低，而包括omega-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）在内的其他脂肪酸对ASBT功能的影响仍不明确。因此，研究人员开展本研究以阐明DHHC酰基转移酶在胃肠道各段的表达、鉴定参与ASBT S-酰化的酶，并探究n-3 PUFAs对ASBT功能及胆汁酸吸收的影响与机制。

研究内容与结论方面，研究人员首次展示了DHHC酰基转移酶在胃肠道全段的独特差异表达，提供了DHHC21在ASBT S-酰化中作用的新证据；进一步证明n-3 PUFAs在体外和体内小鼠模型中通过不依赖S-酰化的直接结合抑制ASBT功能与胆汁酸吸收。研究意义在于为可作为辅助治疗靶点、增强ASBT抑制在代谢性疾病和MASLD中疗效的调控因素提供了新见解。

主要关键技术方法（不超过250字）：研究采用HEK293细胞及稳定转染人ASBT-V5的2BT细胞进行体外实验；以Na⁺依赖性³H-牛磺胆酸（TC）摄取和生物发光胆汁酸探针（CA-SS-Luc）摄取两种方法评估ASBT功能；采用酰基树脂辅助捕获（Acyl-RAC）检测S-酰化；采用炔基脂肪酸（alkyne-palmitate、alkyne-EPA）代谢标记结合点击化学与NeutrAvidin琼脂糖珠拉下检测脂肪酸与ASBT的直接结合；采用实时定量RT-PCR检测DHHC同工酶及基因表达；采用siRNA敲低DHHC21；动物实验使用8–10周龄C57BL6/J小鼠（购自Jackson Laboratories）喂饲12周高脂饮食或补充鱼油的高脂饮食；并进行细胞表面生物素化、Western blot、LDH活性、肝脏脂质提取、粪便胆汁酸提取与总胆汁酸测定及组织病理学分析。人肠道组织RNA来自健康成年器官捐献者（Gift of Hope）。

研究结果：2.1 ASBT异戊烯化模拟体引起转运活性增加。研究人员在ASBT-V5融合蛋白C端下游添加与人RAS基因相同的CAAX盒构建ASBT-V5-CAAX，该基序经异戊烯化使C-15（法尼基）或C-20（香叶基香叶基）脂肪酸连接到半胱氨酸残基并生成疏水C端。结果显示ASBT-V5-CAAX的基础活性（以Na⁺依赖性³H-TC摄取判断）高于ASBT-V5，CA-SS-Luc摄取同样更高，并以总V5表达归一化；细胞表面生物素化显示ASBT-V5-CAAX在质膜上的丰度相对膜相关钙黏蛋白明显低于ASBT-V5。结论为饱和脂肪酸基团直接连接ASBT总体增加其基础活性。2.2 ASBT活性被EPA和DHA降低。2BT细胞以100 μM DHA或EPA孵育15 h后，Na⁺依赖性³H-TC摄取显著下降，生物发光实验进一步证实DHA和EPA降低ASBT活性；洗去EPA培养基并恢复24 h后ASBT活性恢复至对照水平，LDH活性在对照与EPA或DHA处理细胞间无显著差异，提示初始下降不太可能源于细胞死亡。2.3 补充作为n-3 PUFAs来源的鱼油改变肠道胆汁酸处理。鱼油补充未改变体重变化，但显著降低肝/体重比；H&E和油红O染色显示鱼油减轻肝脂肪变性，并降低肝脏甘油三酯、肝脏胆固醇和血清胆固醇；鱼油增加粪便胆汁酸，提示胆汁酸吸收减少，而不改变回肠ASBT mRNA；回肠小异二聚体伴侣（SHP）mRNA（胆汁酸受体FXR的靶基因）表达降低，进一步支持胆汁酸吸收减少；同时肝脏CYP7A1 mRNA（胆汁酸合成关键酶）表达增加，CYP27A1表达增加，而CYP8B1表达不变。结论为在高脂饮食中补充omega-3脂肪酸降低ASBT活性，且不太可能通过改变其回肠蛋白水平实现，ASBT功能下降触发肝脏胆汁酸合成代偿性增加，可解释肝脏与血清胆固醇降低。2.4 EPA与ASBT的直接结合。炔基EPA代谢标记结合点击化学与亲和拉下显示EPA直接结合ASBT（炔基棕榈酸为阳性对照）；羟胺处理显示结合炔基EPA的ASBT大部分抗洗脱，而结合炔基棕榈酸的ASBT高度敏感，表明EPA结合机制不同于S-酰化。2.5 肠道DHHC酰基转移酶的表达。研究人员检测了DHHCs在人和小鼠胃肠道及小鼠不同肠段分离肠上皮细胞中的相对mRNA表达，发现DHHC3、C5、C6、C12、C15、C17、C18、C20和C21在胃肠道各区相对丰富，各DHHC酶在肠道和结肠各段呈差异表达模式，分离肠上皮细胞中多数DHHCs表达模式与黏膜相似。2.6 DHHC21参与ASBT S-酰化。靶向DHHC21的siRNA特异性降低DHHC21 mRNA而不影响其他同工酶；Acyl-RAC显示敲低DHHC21显著降低ASBT S-酰化，同时生物发光法显示ASBT-V5功能下降，强烈提示DHHC21参与ASBT的S-酰化并维持其转运活性。

讨论部分总结：研究人员及其他研究者已表明回肠ASBT在基础水平被S-酰化，S-酰化抑制剂降低其转运活性；肠道上皮细胞基底侧膜的另一胆汁酸转运体Ostα同样被脂肪酸S-酰化且该修饰对其转运功能至关重要，提示脂肪酸调控与S-酰化是肠道胆汁酸吸收的关键调控过程。DHHC同工酶具有差异的细胞定位及对脂质和靶蛋白的底物特异性，但其沿肠道和结肠的分布此前未知；本研究显示DHHC5是人和小鼠肠道黏膜及分离肠上皮细胞中表达最丰富的DHHC，DHHC5与质膜及内吞囊泡相关并为CD36脂肪酸转运体的关键调控因子，其在肠道中的其他功能尚待研究。研究人员因DHHC21既往被证明调控肠道屏障功能而聚焦该酶，siRNA与Acyl-RAC结果强烈提示DHHC21参与ASBT S-酰化，敲低后ASBT功能下降进一步支持这一点；DHHC21此前被证明是Ca²⁺-钙调蛋白依赖性酰基转移酶、对CD4⁺ T细胞活化至关重要，功能缺陷小鼠在脓毒症中肾功能障碍减轻、在全身炎症模型中保护内皮完整性，促炎细胞因子可刺激肠上皮细胞DHHC21表达，功能缺陷突变小鼠免受烧伤诱导的肠屏障功能障碍，本研究为其在肠道中的功能增添了新见解。异戊烯化模拟体结果强烈提示饱和C15或C20脂肪酸直接连接ASBT显著增加其活性；ASBT-V5-CAAX总蛋白水平低于未标记蛋白，可能反映转染效率下降或蛋白稳定性改变，既往研究显示异戊烯化改变蛋白稳定性。研究人员此前显示ASBT功能被饱和脂肪酸棕榈酸增强、被单不饱和脂肪酸油酸降低；本研究新数据显示DHA和EPA直接影响ASBT功能、降低其转运活性，并首次提供EPA直接结合ASBT的证据，且该结合抗羟胺裂解，提示机制不同于S-酰化；近期研究显示EPA形成亚甲基桥酰化PDK1色氨酸残基的δ1碳，促进其招募至膜并激活PI3K活性与葡萄糖摄取，未来研究应探索ASBT色氨酸残基在结合EPA中的潜在作用。总体上不同种类脂肪酸可结合ASBT并影响其转运活性，以依赖饱和程度的方式影响胆汁酸吸收；饮食中饱和脂肪酸超载时ASBT功能增加可能是适应性反应，棕榈酸S-酰化增加ASBT活性与胆汁酸吸收，扩大胆汁酸池并增强乳化能力以促进棕榈酸吸收；相反ASBT与n-3 PUFAs结合降低胆汁酸吸收并可能缩小胆汁酸池，可能部分介导其对血浆胆固醇和肝脂肪变性的有益作用。研究人员在饮食诱导肝脂肪变性模型中直接考察疾病背景下的胆汁酸调控，发现鱼油补充在不依赖体重下降的情况下减少肝脏脂质蓄积，表明其对脂肪变性作用的特异性；鱼油补充增加肝脏胆汁酸合成酶表达，与既往人类和小鼠研究一致。需注意n-3 PUFAs喂养动物的改善可能源于饱和脂肪暴露减少、n-3 PUFAs直接作用或两者兼有；n-3 PUFAs还通过抑制脂肪酸合成、增加β-氧化、减少VLDL分泌和血TG水平及肝脏蓄积等多方面调节脂质代谢，并可能通过调节乳糜管通透性和乳糜微粒转运减少肠道脂肪吸收，还可能影响胆固醇吸收与合成等多个方面，因此鱼油对胆固醇和脂质代谢的有益作用是多因素的。本研究结果支持回肠FXR靶基因表达降低（提示回肠肠上皮细胞内胆汁酸水平降低）及粪便胆汁酸升高，共同提示胆汁酸吸收减少，继而因回肠FXR介导的负反馈抑制减弱而增加肝脏胆汁酸合成。研究局限在于未直接测定胆汁酸合成率、吸收率及循环胆汁酸池大小；CYP7A1升高是对吸收下降的代偿反应，数据无法确定该升高是否足以扩大胆汁酸池，结论仍具推测性，未来将研究n-3 PUFA介导的胆汁酸吸收下降在多大程度上促成脂肪吸收改变及对肝脂肪变性的保护。饮食鱼油下ASBT表达不太可能改变，与翻译后调控一致；体外和体内实验的集体证据强烈提示EPA和DHA通过翻译后机制降低ASBT活性，直接结合可能是其转运活性下降的原因；其他潜在机制包括改变质膜脂筏组成，既往研究显示ASBT活性对蛋白在质膜脂筏微结构域中的定位敏感；EPA掺入质膜在洗脱后24 h仍可能稳定，而本数据显示EPA对ASBT功能的影响可被过夜洗脱逆转，且ASBT半衰期短，因此观察到的功能下降很可能源于与ASBT的直接结合而非膜脂筏组成改变。

研究结论翻译：当前研究结果提供了一个新平台，应推动未来研究解决重要的遗留问题。例如，未来研究需评估EPA与ASBT结合的分子基础；开发体内生物发光方法对于在活体动物中实时直接测量鱼油及其他类型脂肪酸富集饮食期间胆汁酸吸收的动态变化至关重要。总体而言，本研究呈现的数据揭示了调控胆汁酸吸收的新调控通路，可作为有效辅助治疗靶点以增强胆汁酸相关疾病的治疗。