《International Journal of Molecular Sciences》：Platelet miRNA-Based Signature as a Potential Non-Invasive Tool for Discriminating Patients with Secondary Progressive Multiple Sclerosis from Healthy Individuals
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多发性硬化（MS）缺乏能够可靠反映疾病相关病理生理改变的微创生物标志物，尤其是在疾病的进展阶段。由于血小板参与血栓炎症信号传导，并且是调节性miRNA的主要血管载体，研究人员研究了血小板miRNA的改变是否与MS中的血小板高反应性相关，以及这些改变是否通过检测
多发性硬化（MS）缺乏能够可靠反映疾病相关病理生理改变的微创生物标志物，尤其是在疾病的进展阶段。由于血小板参与血栓炎症信号传导，并且是调节性miRNA的主要血管载体，研究人员研究了血小板miRNA的改变是否与MS中的血小板高反应性相关，以及这些改变是否通过检测巨核细胞而源于血小板生成过程。研究人员通过透射电子显微镜、流式细胞术、ELISA、基于微阵列的miRNA谱分析和实时PCR验证，分析了MS患者和健康对照者的血小板及巨核细胞。采用逻辑回归和生物信息学分析评估其潜力和生物学相关性。MS血小板表现出高反应性表型，其特征为脱颗粒增强、微粒释放增加、P-选择素表达升高以及胶原诱导的聚集增强。GPVI水平在血小板中显著升高，但在巨核细胞中保持不变。miRNA谱分析显示血小板中广泛下调，而巨核细胞中miR-223-3p选择性上调。在微阵列筛选后，对10个选定miRNA的PCR验证显示血小板中广泛下调，而仅miR-223-3p在MS患者的巨核细胞中显著上调。一个双miRNA模型（let-7a-5p和miR-146a-5p）显示出良好的内部区分能力（AUC = 0.89；敏感性89%；特异性85%），但外部验证性能较低（C-index = 0.66；敏感性50%；特异性73%）。MS与独特的血小板miRNA特征相关，该特征与获得性血小板高反应性和囊泡化有关。血小板来源的let-7a-5p和miR-146a-5p是潜在的无创生物标志物候选分子，尽管其诊断效用需要在更大规模的独立队列中进一步验证。
研究背景与意义
多发性硬化（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性和神经炎症性疾病，以血脑屏障（BBB）破坏、免疫细胞浸润、脱髓鞘和进行性神经变性为特征。MS的临床病程具有异质性，包括复发缓解型（RRMS）和进展型，后者又分为原发进展型（PPMS）和继发进展型（SPMS），这些亚型在疾病活动模式、残疾累积和进展方面存在差异。尽管磁共振成像（MRI）和脑脊液寡克隆带检测是MS诊断的核心手段，但这些方法对疾病进展的分子机制提供的洞察有限。因此，识别能够反映MS相关全身性病理生理改变的微创分子生物标志物仍是未满足的临床需求。越来越多的证据表明，MS不仅是CNS局限性疾病，还涉及全身性血管和血栓炎症失调。血小板日益被认为是炎症和血管完整性的活跃调节因子，其功能远超传统止血角色。然而，针对MS中血小板生物学的研究仍极为有限。血小板来源的miRNA已成为有前景但尚未充分探索的生物标志物候选。尽管无核，血小板保留了复杂的分子机制，包括丰富的miRNA库，这些miRNA在转录后水平调控基因表达，并可能反映血小板功能状态的变化。本研究旨在识别具有潜在无创工具价值的血小板miRNA特征，以区分SPMS患者与健康个体。
研究内容与结论
研究人员对MS患者和健康对照者的血小板及其前体细胞巨核细胞进行了miRNA表达谱分析，采用微阵列筛选与实时PCR验证相结合的两阶段方法。同时，利用透射电子显微镜（TEM）和流式细胞术表征血小板超微结构和激活状态，以探究miRNA谱改变是否与血小板功能障碍相关。研究发现MS血小板表现出高反应性表型，包括脱颗粒增强、微粒释放增加、P-选择素表达升高和胶原诱导聚集增强。GPVI水平在血小板中显著升高，但在巨核细胞中保持不变。miRNA谱分析显示血小板中广泛下调，而巨核细胞中miR-223-3p选择性上调。通过逻辑回归和生物信息学分析，研究人员确定了一个双miRNA模型（let-7a-5p和miR-146a-5p），在内部验证中显示出良好的区分能力（AUC = 0.89），但外部验证性能较低（C-index = 0.66）。这些发现将血小板定位为MS病理生理的活跃放大器，并作为功能信息丰富的生物标志物来源。
关键技术方法
研究采用了多种关键技术方法：流式细胞术评估血小板激活标志物（包括血小板聚集物PAG形成、血小板微粒PMPs和P-选择素CD62P表达）；透射电子显微镜（TEM）定性评估血小板超微结构；ELISA定量检测血小板和巨核细胞中GPVI受体表达水平；微阵列分析（SurePrint G3 Human miRNA r21 Array Kit）进行miRNA表达谱筛选；实时PCR（TaqMan探针）验证选定miRNA的表达。样本来源于26名MS患者（18名女性，8名男性，年龄52±12岁）和26名健康对照者（年龄47±13岁，14名女性，12名男性），另设独立外部验证队列（22名MS患者和22名对照者）。MS患者按修订McDonald标准诊断，SPMS病程按Lublin等标准定义，未接受免疫调节剂或激素治疗。
研究结果
2.1 MS中血小板囊泡化和货物分泌增强的特征：TEM分析显示，对照组血小板呈典型盘状形态，超微结构保存完好，细胞质中α颗粒和致密颗粒密集分布。而MS患者血小板表现出显著的超微结构改变，包括α颗粒和致密颗粒数量明显减少、形成大量无细胞器区域、细胞形态高度不规则伴多个伪足、开放小管系统（OCS）更为突出和结构复杂，以及细胞外空间出现大量血小板来源微粒（PMPs），表明MS患者存在自发性血小板过度激活和过度脱颗粒。
2.2 MS血小板对胶原的敏感性增强，聚集、囊泡化和P-选择素表达增加：流式细胞术分析显示，在静息状态和胶原刺激条件下，MS患者的循环血小板激活状态和反应性均显著增强。未受刺激时，MS组血小板聚集物（PAGs）约增加2倍（12.8% vs. 6.6%），PMPs增加超过3倍（12.4% vs. 4.0%），P-选择素阳性血小板水平增加超过10倍（6.2% vs. 0.5%）。胶原刺激后，这种高反应性特征持续存在，表明MS存在组成性和激动剂放大的血小板高反应性。
2.3 GPVI表达增加驱动MS血小板的促粘附表型：ELISA分析显示，MS患者血小板裂解物中GPVI浓度比对照组高1.65倍（6.75 ± 4.32 ng/mL vs. 4.09 ± 2.13 ng/mL），而巨核细胞中GPVI浓度无显著差异。这表明血小板GPVI水平升高并非源于前体细胞的变化，可能独立于巨核细胞差异而产生。
2.4 血小板和巨核细胞miRNome的微阵列筛选分析：微阵列分析显示MS患者血小板和巨核细胞中miRNA表达广泛失调。在血小板中，130个miRNA显著增加，67个显著减少；在巨核细胞中，124个miRNA表达增加，77个表达减少。根据预定义的统计和生物学标准，仅10个miRNA满足所有选择要求，包括与GPVI介导的血小板激活、胶原依赖性粘附和血小板微粒释放等功能直接相关的miRNA。
2.5 实时PCR miRNA分析：实时PCR验证显示，MS患者血小板中除miR-223-3p外，所有检测miRNA均显著下调，其中let-7a-5p下降最显著（约19倍）。在巨核细胞中，仅miR-223-3p在MS组中表达显著增加（约10倍），其余miRNA无显著差异。校正性别、年龄、BMI和血小板计数后，除血小板中miR-16-5p外，所有miRNA的统计学显著性均保持。
2.6 互相关和探索性因子分析（EFA）：两种细胞类型中检测的miRNA表现出显著的互相关。血小板数据的Kaiser–Meyer–Olkin（KMO）测量表明采样充分性可接受（KMO = 0.72），巨核细胞数据充分性较低（KMO = 0.64）。两个因子分别解释了血小板和巨核细胞总方差的60.6%和50.0%。miR-223-3p在两种细胞类型中均表现出独特的载荷模式。
2.7 逻辑回归分析：血小板let-7a-5p和miR-146a-5p表达作为区分MS患者与对照的预测指标。双变量逻辑回归模型可解释受试者分类中至少一半的方差（Cox-Snell R2 = 0.50，Nagelkerke R2 = 0.67），内部验证敏感性89%，特异性85%。但在外部验证队列（22名MS患者和22名对照者）中，模型表现中等（Harrell's C-index = 0.66），敏感性降至50%，特异性为73%，表明模型在外部队列中的区分性能有限。
2.8 KEGG和基因本体（GO）分析：KEGG通路富集分析显示，最显著富集的通路与神经变性相关，包括“多疾病神经变性通路”、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病和帕金森病。其他富集通路包括MAPK信号传导、内吞作用和产热作用。此外，还涉及细胞信号传导和应激反应通路，如活性氧化学致癌、Rap1信号传导、粘着斑、内质网蛋白加工、Wnt信号传导和mTOR信号传导。PPI网络分析确定了与免疫调节（IL6、RORC、IRAK1）、BBB完整性和血管功能（COL4A1、PDGFRB）、髓鞘形成（GALC、LINGO1）、氧化应激（NOX4、GPX6）、突触传递（GRIA3、SYT1）和表观遗传调控（EHMT2）相关的潜在蛋白相互作用网络。
讨论总结
研究提供了MS患者血小板miRNA特征可区分MS患者与健康对照的证据，这一分子特征伴随与血小板反应性增加一致的功能改变。血小板miRNA的下调提示转录后调控控制的改变，可能促成MS中观察到的血小板高反应性表型。let-7a-5p在MS血小板中显著下调，其下调促进促炎性小胶质细胞激活，而上调则有利于抗炎表型。miR-146a-5p是已知的炎症负调控因子，通过抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB信号轴发挥作用，其表达降低可能促进促炎表型。miR-223在巨核细胞水平选择性改变，表明其失调可能源于血小板生成过程，反映MS中血小板前体细胞的疾病特异性重编程。双miRNA模型在内部验证中表现良好，但外部验证性能下降，提示需要进一步优化和更大规模、更多样化队列的验证。
研究结论
本研究识别了血小板来源的miRNA作为MS生物学中先前未被认识的机制相关层面。关键调控miRNA（特别是let-7a-5p和miR-146a-5p）的协调下调可能在MS病理生理中具有功能相关性。计算机分析表明，这些miRNA与涉及神经炎症、BBB功能障碍、免疫调节和神经变性过程的多条生物学通路中的众多靶基因相关。尽管双miRNA特征在内部验证中表现出良好的区分性能，但其在外部队列中的性能下降（尤其是低敏感性）表明，在临床应用前需要进一步优化和验证。总之，这些发现将血小板定位为MS病理生理的活跃放大器，并作为稳健、功能信息丰富的生物标志物来源。
