《International Journal of Molecular Sciences》：Erythrocyte Membrane β-Adrenoreactivity as a Systemic Adrenergic Phenotype Associated with Ventricular Tachyarrhythmia in Heart Failure Patients Undergoing Cardiac Resynchronization Therapy
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本研究旨在对猫膀胱中大麻素受体1型（CB1）与2型（CB2）的基因及蛋白表达进行定性与定量表征，并描述其细胞分布。样本取自11只无下尿路疾病史的猫的尸体，采用逆转录定量PCR（RT-qPCR）、Western blot及免疫荧光进行分析。采用配对t检验（p <
本研究旨在对猫膀胱中大麻素受体1型（CB1）与2型（CB2）的基因及蛋白表达进行定性与定量表征，并描述其细胞分布。样本取自11只无下尿路疾病史的猫的尸体，采用逆转录定量PCR（RT-qPCR）、Western blot及免疫荧光进行分析。采用配对t检验（p < 0.05）分析尿路上皮与逼尿肌的平均荧光强度。CNR2转录本在两个隔室中均可检出，而CNR1转录本未能检出。Western blot检测到CB1与CB2条带。CB1R免疫反应性（CB1R-IR）在尿路上皮中稀疏，偶见于伞细胞与基底细胞，并见于内皮细胞、壁内神经元、神经纤维及逼尿肌平滑肌细胞。CB1R-IR在逼尿肌中显著更高（p = 0.0006）。CB2R-IR在伞细胞中呈显著染色，在基底细胞中呈弱染色；亦见于神经纤维束、壁内神经元、逼尿肌平滑肌细胞及血管结构。CB2R-IR在尿路上皮中显著更高（p < 0.0001）。上述发现为将内源性大麻素系统作为猫下尿路疾病潜在治疗靶点的研究提供了分子基础。
**研究背景与问题**
猫下尿路疾病（FLUTD）是猫科医学中常见且具临床相关性的一组疾病，包括猫特发性膀胱炎（FIC）、尿石症、尿路感染及神经源性膀胱功能障碍等。其中FIC最为常见，因其多因素性及病理生理机制尚未完全阐明而成为治疗难点，涉及环境应激、神经内分泌失调及膀胱感觉处理改变。猫膀胱壁由黏膜（尿路上皮、基底膜与固有层）、肌层（逼尿肌）及外层（浆膜/外膜）构成；尿路上皮为高度分化的复层上皮，由基底细胞、中间细胞与表层伞细胞组成，除作为被动屏障外，还被认为是一种能释放ATP、一氧化氮、细胞因子及神经营养因子等介质的主动感觉与信号结构，从而调节传入神经活动并参与膀胱功能调控。内源性大麻素系统（ECS）由大麻素受体1型（CB1R）与2型（CB2R）、内源性配体（anandamide，AEA与2-arachidonoylglycerol，2-AG）及代谢酶（MAGL与FAAH）组成，已成为痛觉、炎症及平滑肌活动等重要生理过程的重要调节者。大麻素受体已在人及实验动物的非肿瘤性膀胱的尿路上皮、逼尿肌及神经成分中被定位；激活大麻素受体可减弱离体人逼尿肌条的电诱发收缩，支持其功能作用。Mukerji等报道膀胱疼痛综合征及特发性逼尿肌过度活动患者中CB1R免疫反应性神经纤维增多，且神经纤维密度与疼痛或尿急相关；另一项人体研究发现逼尿肌过度活动患者尿路上皮CNR1转录本水平升高而逼尿肌表达降低。在大鼠、小鼠、猪、狗、猴及人中的功能研究显示，激活大麻素受体可调节膀胱收缩性、抑制传入神经活动并减轻小鼠实验性膀胱炎模型的炎症。然而，尽管在其他物种中证据不断增加，大麻素受体在猫膀胱中的存在与分布尚未被探索；鉴于猫下尿路疾病的临床相关性及大麻素类药物的新兴治疗前景，理解这些靶点的分子与解剖分布至关重要。因此本研究旨在采用RT-qPCR、Western blot及免疫荧光技术表征猫膀胱中CB1R与CB2R的基因（CNR1与CNR2）与蛋白表达及细胞分布。
**研究内容与结论**
研究人员首次对家猫膀胱中大麻素受体表达进行了表征，证明CB1R与CB2R在尿路上皮、肌层、血管及神经隔室中存在差异分布，为ECS参与猫膀胱生理学建立了Anatomical基础。研究证实猫膀胱中存在CNR2基因表达而CNR1未能检出，并提示固定样本不适宜用于RT-qPCR；CB2R在尿路上皮与神经成分中的显著表达提示其参与上皮信号与感觉调制，而CB1R则与神经及血管调节相关。该研究为将ECS作为猫下尿路疾病潜在治疗靶点的功能研究提供了分子与解剖学依据，并指出需要标准化的猫种属特异性分子方法学。其重要意义在于填补了猫膀胱大麻素受体分布的研究空白，为后续功能研究与治疗开发奠定基础。
**关键技术方法**
研究为观察性、死后分析、横断面研究，纳入11只因与尿路无关疾病死亡或安乐死的私家猫尸体，纳入标准为无FLUTD病史且死因与尿路疾病无关，经病理学家大体评估无异常者入选；样本于死后4 h内采集，作者所在机构为博洛尼亚大学。关键技术方法包括：以手术刀与解剖镊在立体显微镜下分离尿路上皮与逼尿肌；采用4%多聚甲醛固定样本（n = 11）用于免疫荧光与基因表达，部分猫（n = 4）另取RNALater保存的新鲜组织用于RT-qPCR、液氮速冻组织用于Western blot；以苏木精-伊红（H&E）染色冷冻切片排除亚临床膀胱病变；分别采用RNeasy FFPE kit与TRI Reagent结合NucleoSpin RNA II提取RNA，经iScript RT Supermix逆转录后以SYBR green法在CFX96热循环仪上行RT-qPCR，以YWHAZ为参照基因、ΔCt法分析，并以猫脑转录本作阳性对照；Western blot采用SDS缓冲液匀浆、NuPAGE 4–12% bis-Tris Plus凝胶分离、半干转印至硝酸纤维素膜、化学发光底物显影并以Quantity One软件分析条带分子量；免疫荧光在14 μm冷冻切片上行单标与双标染色，以ImageJ的Color Histogram（gMEAN）工具定量，Nikon Eclipse Ni显微镜观察；统计分析采用Shapiro–Wilk检验与配对t检验（p < 0.05），以GraphPad Prism v.8完成。
**研究结果**
2.1 CNR1、CNR2的定量实时PCR：参照基因YWHAZ在RNALater保存样本中Ct为21.3 ± 0.42、在4%多聚甲醛固定样本中Ct为33.3 ± 2.1；cypA仅在RNALater保存样本中可检出（Ct 30.1 ± 2.6）且变异大，故选用YWHAZ作为qPCR数据归一化的参照基因。在RNALater保存样本（n = 4）中，所有个体的尿路上皮与逼尿肌均检出CNR2转录本，而CNR1始终未能检出；固定样本中CNR1与CNR2均不可检出。尿路上皮与逼尿肌间CNR2基因表达未见显著统计学差异（配对t检验，p = 0.0886）。
2.2 Western blot：CB1R检测到约50 kDa条带（猫CB1R理论分子量为52,887 kDa），CB2R检测到约40 kDa条带（猫CB2R理论分子量为30–56 kDa），各抗体均显示接近预期分子量的主要条带。
2.3 免疫荧光：2.3.1 CB1R——尿路上皮中CB1R-IR基本缺失，仅偶见孤立的伞细胞与基底细胞呈弱至中度胞质染色；逼尿肌平滑肌细胞中CB1R-IR微弱；血管隔室中内皮细胞及动脉壁平滑肌细胞呈中度至明亮CB1R-IR；壁内神经元与神经纤维束呈中度胞质CB1R-IR。CB1R-IR强度在逼尿肌（mean ± SD：5860 ± 3293 gMEAN；中位数4213）显著高于尿路上皮（1966 ± 1656 gMEAN；中位数1143），配对t检验t(10) = 4.938，p = 0.0006，平均配对差值为3894 gMEAN（95% CI：2137–5651）。2.3.2 CB2R——尿路上皮中CB2R-IR显著见于伞细胞胞质，呈清晰一致的分布模式，这些大而呈多边形或梨形的细胞明显大于中间层与基底层的细胞；免疫标记延伸至朝向中间细胞层的短胞质突起，但未见跨越超过一至两层细胞；中间细胞层CB2R-IR微弱，呈由浅至深的递减梯度，最浅层中间细胞呈颗粒状染色模式，常位于核周胞质；基底细胞基本阴性，仅偶见弱至中度免疫反应性。逼尿肌与血管结构中CB2R-IR为弱至中度；壁内神经元与神经纤维呈明亮CB2R-IR，这些神经成分常与SP阳性膨体密切关联；此外逼尿肌内一小群常邻近SP免疫反应性神经纤维的细长细胞呈中度CB2R-IR，据其形态与解剖分布推测可能为间质细胞或肌成纤维细胞样细胞，但未用特异性标志物确认。CB2R-IR强度在尿路上皮（mean ± SD：53,357 ± 10,634 gMEAN；中位数55,740）显著高于逼尿肌（14,499 ± 5709 gMEAN；中位数13,984），配对t检验t(10) = 10.71，p < 0.0001，平均配对差值为38,858 gMEAN（95% CI：30,771–46,945）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次表征家猫膀胱中大麻素受体表达，证明CB1R与CB2R在尿路上皮、肌层、血管及神经隔室中的差异分布，为ECS参与猫膀胱生理学建立了Anatomical基础；该结果与既往在人、啮齿类及非人灵长类中报道大麻素受体存在于尿路上皮、逼尿肌与神经成分的结果一致，尤其与CB2R在尿路上皮相对逼尿肌占优势的报道相符。分子分析显示，固定样本中两种受体基因均不可检出，而RNALater保存样本中CNR2均可测得（n = 4），这与甲醛固定导致RNA片段化与化学修饰、损害核酸完整性并降低下游基因表达分析可靠性的既往文献一致，故固定样本中转录本不可检出可归因于RNA降解而非基因表达的真实缺失，但该观察本身并不能确立固定是唯一解释；RNALater保存样本中CNR1转录本不可检出应解释为在所采用分析条件下获得的结果，而非该基因在猫膀胱中不表达的 definitive证据，其可能原因包括转录本丰度低、体组织样本中稀疏分布的表达细胞所致转录本稀释、所检组织区域差异及转录本与蛋白周转差异，且本研究采样在死后4 h内完成亦可能影响基因降解。CB1R在全部样本中于试验条件下未检出可测基因表达（CNR1），尽管免疫荧光与Western blot证实存在蛋白表达，这可能反映猫膀胱中CB1R转录水平极低、低于常规RT-PCR检测阈值，未来需采用Digital-PCR或RNA测序等更敏感方法准确量化CNR1转录本，并可采用CB1R阳性隔室（如逼尿肌或血管相关细胞）的原代细胞培养等细胞特异性方法阐明其转录谱。使用RNA稳定液保存的新鲜组织时，所有样本均检出CNR2基因表达，且观察到逼尿肌CNR2 mRNA水平较尿路上皮有升高趋势但未达统计学显著性；与之相反，免疫荧光与蛋白分析显示尿路上皮尤其伞细胞中CB2R蛋白表达明显更高，这种基因与蛋白表达的表观分离提示膀胱中CB2R表达受复杂调控机制影响，一种可能解释是蛋白表达较高的区域因翻译效率增加与转录本周转加快而可检出的mRNA水平较低，反映受体合成与利用的动态调节，另一种可能是转录后与翻译后机制包括mRNA稳定性、蛋白转运及受体再循环差异参与其中，类似的mRNA与蛋白水平分离已在其他生物系统中被描述。Western blot显示CB1R与CB2R条带分别约为50与40 kDa，CB1R条带与预测的猫CB1R分子量（约52.9 kDa）一致，CB2R条带与约30–56 kDa相符；附加条带可能源于糖基化差异所致电泳异质性，但不能排除受体加工或降解及抗体交叉反应，故所观察分子量支持但未确立受体身份，附加条带不能归因于特定受体亚型；本WB assay作为初步与探索性实验用于验证抗体反应性/特异性及所研究受体在猫膀胱中的分子蛋白量，但不能显示两种受体信号是否存在于每只动物或评估动物间变异；选择性剪接是CB1R/CB2R异质性的另一可能解释，人和小鼠中已表征N端序列改变的变异体，小鼠脑cDNA测序鉴定出缺失39与62个氨基酸的mCB1a与mCB1b，转染HEK293细胞的Western blot显示mCB1b糖基化明显降低，在大鼠与小鼠中已鉴定不同CB2R亚型（CB2a、CB2b、CB2c与CB2d），其表达呈个体、物种与组织依赖性，尽管据作者经验应有更强的替代条带才能解释显著数量的其他蛋白亚型。本研究中CB1R免疫反应性呈有限且异质的分布，尿路上皮中基本缺失，仅孤立细胞偶见中度染色，但CB1R见于壁内神经元与神经纤维、血管成分及平滑肌细胞，此模式与既往大鼠、猪、猴及人研究一致，其中CB1R主要与神经及血管隔室相关并参与神经递质释放与血管张力调节；逼尿肌相关神经结构中CB1R-IR的存在支持其参与膀胱运动功能调节；值得注意的是CB1R与CB2R-IR细胞亦见于与SP免疫反应性纤维密切关联处。相反，CB2R在尿路上皮内呈显著且特异的表达模式，伞细胞呈明亮免疫反应性，向中间层递减，基底细胞表达极少；尿路上皮现被认为不仅是被动屏障，还是能响应机械与化学刺激释放ATP、一氧化氮、细胞因子及神经营养因子等介质的主动感觉与信号界面；膀胱充盈时尿路上皮牵张诱导ATP释放，后者通过嘌呤能受体激活传入神经通路并发挥关键作用，ATP信号改变与膀胱超敏及下尿路疾病相关，但尚无已发表证据表明CB2R在猫膀胱活动中对ATP水平有直接作用。逼尿肌内壁内神经元与神经纤维可见CB2R-IR，CB2R阳性结构与SP免疫反应性神经纤维之间的密切解剖关联提示其参与感觉调制；间质细胞与肌成纤维细胞样细胞日益被认为膀胱收缩性与信号整合的关键调节者，与尿路上皮及神经成分形成功能性合胞体；小鼠与人类细胞的实验研究证明激活大麻素受体可调节膀胱收缩性并提高排尿阈值，在正常与炎症条件下均如此，这些效应被认为源于外周与中枢机制的结合，包括抑制传入神经活动与调节平滑肌兴奋性。大麻素依赖性调制膀胱传入活动的直接证据主要在实验物种中获得：Walczak等证明小鼠中CB1R依赖性抑制机械诱发的膀胱传入放电，而豚鼠中CB2R激活选择性抑制黏膜传入；这些发现为猫的观察提供机制背景，但未证明猫中存在等效的受体功能。在人体中，临床研究已探讨大麻素用于多发性硬化相关尿路症状（CAMS-LUTS）如神经源性膀胱功能障碍患者的尿急、尿频与尿失禁；尽管CAMS-LUTS研究报告口服大麻提取物或THC可减少尿失禁，但一项专门的nabiximols（Sativex?）试验尽管在若干次要指标上有改善，却未达到其主要尿失禁终点；此外FAAH抑制剂ASP3652在涉及287名间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征女性的随机试验中未显示疗效；因此猫膀胱组织中大麻素受体的存在为功能研究提供了依据，但并未确立给予大麻素可改善猫下尿路疾病。研究局限性包括：样本量有限且限于死后组织，可能不能完全代表生理变异；鉴于样本量小未行亚组分析；未进行功能测定，故关于受体活性的结论仍属推测；个体病史不完整可能限制对潜在药物相关效应的评估；年龄跨度大（1–18岁）及死亡前影响患者的不同状况是变异性的可能来源；此外H&E在冷冻切片而非石蜡包埋组织上进行，导致特定处理伪影；免疫荧光引入另一组潜在局限，包括抗体交叉反应、猫表位的识别不完全、固定依赖性表位可及性及组织自发荧光。
结论部分译文：本研究首次证明猫膀胱中存在大麻素受体CB1R与CB2R及其差异分布，以及CNR2（原文作CN2R）基因表达而CNR1未见表达。由于基因可能降解，采用固定样本进行RT-qPCR并不可取。CB2R在尿路上皮与神经成分中的显著表达提示其在上皮信号与感觉调制中的作用，而CB1R与神经及血管调节相关。上述发现提示ECS参与猫膀胱生理学。此外，需要标准化的、猫种属特异性的分子方法学。
