《International Journal of Molecular Sciences》：CASK Positively Regulates Keratinocyte Proliferation and Modulates the EGFR-ERK-p21 Signaling Axis
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CASK是一种具有多种细胞功能的多结构域支架蛋白，但其在角质形成细胞中的作用尚不清楚。本研究建立了CASK沉默的人HaCaT角质形成细胞模型以探究其生物学功能。研究发现，CASK定位于质膜、胞质和细胞核，其沉默抑制角质形成细胞增殖并诱导G1期阻滞。RNA测序（
CASK是一种具有多种细胞功能的多结构域支架蛋白，但其在角质形成细胞中的作用尚不清楚。本研究建立了CASK沉默的人HaCaT角质形成细胞模型以探究其生物学功能。研究发现，CASK定位于质膜、胞质和细胞核，其沉默抑制角质形成细胞增殖并诱导G1期阻滞。RNA测序（RNA-Seq）显示，CASK缺失减弱了增殖相关的转录程序。与此一致，CASK沉默增加了p53和p21表达，同时降低cyclin B和磷酸化Rb水平，shCASK细胞中p53和p21 mRNA升高。然而，CASK沉默相关的p21上调并不主要依赖p53活性。机制上，CASK沉默增强了血清诱导的EGFR及下游ERK信号激活，并伴随EGFR配体双调蛋白（amphiregulin）、TGF-α和表皮调节素（epiregulin）表达增加，提示自分泌/旁分泌EGFR信号增强。药理学抑制研究表明，EGFR–ERK信号通路的激活对于CASK沉默后p21上调至关重要。启动子报告基因分析进一步显示，CASK缺陷增强p21转录。总之，这些发现揭示了CASK在调节角质形成细胞生长和细胞周期进程中的先前未被认识的作用。CASK通过限制自分泌/旁分泌EGFR–ERK信号并抑制p21表达来促进角质形成细胞增殖，从而参与表皮稳态和生长控制。
**研究背景与科学问题**
钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK），又称LIN-2，是进化上保守的X连锁基因，编码属于膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族的支架蛋白。CASK包含N端CaMK结构域、L27结构域、PDZ结构域、SH3结构域和C端鸟苷酸激酶（GUK）结构域。CASK在多种器官和组织中广泛表达，以脑组织最高；亚细胞水平定位于细胞质、质膜和细胞核。既往研究最充分的是其在神经系统中的作用，包括突触传递、神经元分化和神经发育，CASK基因突变主要与神经发育障碍相关。然而，CASK在角质形成细胞中的功能尚不明确。EGFR信号通过平衡角质形成细胞增殖与分化在维持表皮稳态中发挥关键作用；p21是细胞周期进程的关键调节因子，也是角质形成细胞生长控制的核心介质。在线虫中，CASK（LIN-2）可促进EGFR（LET-23）定位于外阴前体细胞基底膜结构域，从而激活EGFR/Ras/MAPK级联。基于此，研究人员在HaCaT角质形成细胞中建立CASK沉默模型，系统探究CASK对增殖的调控及其与EGFR信号和p21表达的关系。
**主要技术方法**
研究人员采用慢病毒shRNA和siRNA在HaCaT细胞中沉默CASK，并建立CASK过表达细胞；通过MTT法、台盼蓝计数和BrdU掺入评估细胞生长与增殖；以PI染色流式细胞术分析细胞周期，Annexin V-FITC/PI染色检测细胞死亡；采用RNA-Seq结合π评分与ΔΔπ交互评分及GSEA进行转录组分析；通过免疫印迹、实时PCR、共免疫沉淀、免疫荧光共聚焦和流式细胞术检测表面EGFR；使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（gefitinib、afatinib、osimertinib）、ERK抑制剂U0126及AKT、JNK、p38抑制剂进行药理学干预；并以p21启动子荧光素酶报告基因（含全长、p53结合位点缺失及?180至+8 bp最小启动子构建体）分析转录调控。临床相关性分析使用UCSC Xena转录组（TCGA LUSC队列与GTEx健康肺样本）和CPTAC蛋白质组数据集。研究未涉及特定样本队列来源的自建收集。
**研究结果**
CASK沉默减弱HaCaT细胞增殖与DNA修复相关转录程序：RNA-Seq与ΔΔπ评分显示，对照细胞在无血清向完全培养基转换时增殖和DNA修复程序诱导显著强于shCASK细胞，差异富集通路涉及有丝分裂G1/S转换、DNA合成、S期进程和G2/M检查点；核心主导基因（如CDC6、CDK2、EXO1、BLM、RAD51、CENPM、SPC24、ERCC6L）的血清恢复π评分在对照细胞中均更高；LUSC转录组和蛋白质组数据均显示CASK在肿瘤组织中显著高表达。
CASK沉默抑制角质形成细胞增殖并诱导G1期阻滞：MTT、台盼蓝计数和BrdU掺入实验一致显示siCASK/shCASK降低细胞生长与增殖指数，而CASK过表达增加BrdU掺入；PI流式显示CASK缺失使G1期细胞比例显著增加，血清刺激后S期细胞增加减弱；Annexin V-FITC/PI染色显示72 h内CASK沉默不影响细胞死亡；CaMK选择性抑制剂NR162不影响细胞生长和细胞周期，提示CASK以激酶非依赖方式调控增殖。
CASK沉默诱导的p21表达导致细胞周期阻滞：CASK沉默上调p21蛋白；血清刺激下shCASK细胞cyclin D1和cyclin E升高更明显，而cyclin B表达和Rb磷酸化减弱；血清诱导的p21蛋白和mRNA在shCASK细胞中升高并维持更久；siRNA沉默p21可逆转shCASK细胞的生长抑制及G1期增加、S期减少，表明CASK沉默通过上调p21抑制HaCaT细胞生长。
CASK沉默诱导的p21基因表达不依赖p53：shCASK细胞基础p53蛋白和mRNA水平升高，血清诱导的p53 mRNA下降延迟；p53抑制剂pifithrin-α不影响CASK沉默引起的p21蛋白和mRNA上调；p21启动子缺失p53响应元件后，CASK沉默仍增强其活性，提示p21上调不依赖p53。
CASK沉默通过增加EGFR配体表达增强血清再添加下的EGFR信号：CASK沉默增强血清诱导的EGFR、ERK和JNK磷酸化，但不影响Akt磷酸化；p38磷酸化和EGFR表达在shCASK细胞中减弱，EGFR mRNA降低；血清处理未改变细胞表面EGFR水平；共免疫沉淀显示CASK与EGFR在完全培养基、血清饥饿和EGF刺激条件下存在蛋白相互作用；shCASK细胞中AREG、EREG和TGF-α mRNA在血清饥饿或再添加条件下均升高；共聚焦显示血清刺激后CASK发生核转位（核/胞质比由约0.22升至0.54），EGFR主要滞留于质膜，CASK沉默不影响EGFR定位。
自分泌EGFR-ERK轴介导CASK沉默下的血清诱导p21表达：gefitinib、afatinib、osimertinib和U0126均抑制shCTL与shCASK细胞中血清诱导的p21蛋白表达，而AKTi、SP600125和SB203580无此作用；EGFR TKIs抑制ERK激活；gefitinib和U0126消除血清诱导的p21及AREG、EREG mRNA表达；p21启动子报告基因显示CASK沉默显著增强全长及最小?180至+8 bp启动子活性，且该增强效应在gefitinib或U0126处理下依然存在，提示?180 bp至TATA盒区域是CASK作用的关键调控位点。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CASK对细胞生长的作用具有高度环境与细胞类型依赖性：多项研究显示CASK在多种癌症中促进增殖和肿瘤进展，而早期研究报道CASK在表皮角质形成细胞和内皮ECV304细胞中具有生长抑制作用；本研究结果与既往HaCaT细胞观察不同，将CASK鉴定为角质形成细胞增殖的正向调控因子，且该促生长效应不依赖其CaMK激酶活性，而与减弱EGFR-ERK信号介导的p21表达相关。研究确认角质形成细胞中存在EGFR-ERK-p21信号轴，并将CASK鉴定为该通路先前未被认识的负调控因子：CASK沉默增强EGFR和ERK活性，EGFR TKIs或U0126可抑制shCASK细胞p21表达，而AKT、p38 MAPK和JNK通路对p21调控并非必需。关于p53，血清再添加早期p53 mRNA和蛋白轻度下降而p21短暂升高，可能与生长因子依赖的PI3K/AKT对p53的抑制有关；PFT-α处理和p53响应元件缺失均不能削弱CASK沉默诱导的p21上调，支持其不依赖p53。讨论同时指出HaCaT细胞p53存在功能获得性突变（H179Y和R282Q），突变型p53可能通过p63依赖机制间接调控p21，该轴在CASK缺失条件下是否参与p21上调仍需进一步研究。此外，推测结合于p21启动子?180 bp区域的ERK响应转录因子可能包括Sp1、E2A和c-Jun，但尚待阐明。角质形成细胞因EGFR及其配体高表达而具有组成性自分泌/旁分泌EGFR活性，配体表达受RAS-RAF-MEK-ERK级联调控形成正反馈环路；本研究中shCASK细胞EGFR基因表达降低而配体表达和EGFR磷酸化增强，与既往在微胶质细胞和非小细胞肺癌中CASK沉默升高EGFR水平的报道不同，提示CASK对EGFR信号的调控具有环境依赖性。
结论部分译文：CASK是一种参与细胞增殖调控的多功能支架蛋白。在角质形成细胞中，CASK抑制自分泌/旁分泌EGFR信号，从而限制组成性ERK激活。通过这一机制，CASK抑制p21表达并促进角质形成细胞增殖，突显其作为EGFR-ERK-p21信号轴负调控因子的作用。
