《International Journal of Molecular Sciences》：Stachydrine Hydrochloride Suppresses Hepatocellular Carcinoma Progression by Reprogramming Macrophage Polarization Through the LIF/PI3K/Akt Axis
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）预后不良，主要归因于由M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）塑造的免疫抑制性肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvir
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）预后不良，主要归因于由M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）塑造的免疫抑制性肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）。盐酸水苏碱（stachydrine hydrochloride，SH）是一种源自蒙古草原糙苏（Panzeria alashanica Kupr.）的生物碱，具有抗炎和抗肿瘤作用；然而，其在HCC中的免疫调节作用尚不清楚。本研究利用RAW264.7、THP-1、HepG2和Huh-7细胞系、皮下肿瘤模型以及临床样本的生物信息学分析，探讨了SH是否通过LIF/PI3K/AKT通路调控TAM极化来抑制HCC进展。研究人员发现，SH以剂量依赖方式调节巨噬细胞表型，无明显细胞毒性，促进M1型极化的同时抑制M2型极化及M2型巨噬细胞的自噬，并增强巨噬细胞对HCC细胞的吞噬作用。经SH处理的M2型巨噬细胞条件培养基可抑制HCC细胞的增殖、迁移和上皮间充质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）。机制上，SH抑制M2型巨噬细胞中LIF/PI3K/AKT的激活，而LIF过表达显示出部分抵消SH介导的M2抑制效应的趋势。生物信息学分析将高M2型TAM浸润与HCC不良预后相关联。体内实验显示，SH延缓肿瘤生长，减少瘤内M2型TAM浸润，并降低Ki-67水平。综上，SH通过重塑TIME来抑制HCC进展，这些效应与抑制M2型TAM极化和减弱LIF/PI3K/Akt信号传导相关，揭示了一种新的免疫治疗机制，并支持SH作为HCC免疫治疗中一种有前景的天然药物。
研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，五年生存率不足20%，治疗选择有限。肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）在HCC进展中发挥关键作用，其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是最丰富的免疫细胞群。在HCC中，TAMs主要表现为M2型极化表型，通过分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等促肿瘤因子，促进肿瘤生长、血管生成、免疫逃逸和转移。因此，抑制M2型TAM极化或阻断其下游信号通路是改善HCC免疫治疗的重要方向。盐酸水苏碱（stachydrine hydrochloride，SH）是从蒙古草原糙苏中分离的一种季铵生物碱，具有抗炎、心脏保护和抗肿瘤活性，但其是否通过调控TAM极化影响HCC进展尚未被探索。
研究内容与结论
研究人员通过体外细胞实验、体内荷瘤小鼠模型及临床生物信息学分析，系统研究了SH对巨噬细胞极化的调控作用及其抗HCC机制。结果表明，SH能够促进M1型巨噬细胞极化（上调CD86、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和IL-6），同时抑制M2型极化（下调CD206、TGF-β、IL-10和精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1））。SH还抑制M2型巨噬细胞相关的自噬（降低ATG12和LC3B，恢复P62表达），并增强巨噬细胞对HCC细胞的吞噬功能。机制研究发现，SH通过抑制LIF/PI3K/Akt信号通路发挥上述作用，LIF过表达可部分逆转SH的效应。体内实验中，SH（30 mg/kg）显著抑制H22皮下移植瘤生长，降低瘤内M2型TAM浸润和Ki-67表达，同时升高M1型标志物CD86和一氧化氮（nitric oxide，NO）水平。生物信息学分析基于TCGA-HCC数据集进一步证实，LIF高表达的HCC特征性地表现为M2型巨噬细胞富集和PI3K-Akt通路激活，且高M2型TAM浸润与患者不良预后密切相关。
研究意义
本研究首次揭示了SH通过LIF/PI3K/Akt轴重编程巨噬细胞从M2向M1型极化，进而重塑TIME以抑制HCC进展的新机制。这一发现拓展了SH的抗HCC作用机制——从直接作用于肿瘤细胞延伸至免疫微环境调控，形成了“直接抗肿瘤+免疫调节”的双重作用模式，为天然生物碱的肿瘤免疫药理学提供了新框架，并支持SH作为HCC免疫治疗的候选辅助药物。
主要关键技术方法
- 1.
细胞实验：采用RAW264.7（小鼠巨噬细胞）和THP-1（人单核细胞）进行体外巨噬细胞极化模型构建（LPS+IFN-γ诱导M1型，IL-4+IL-13诱导M2型），以及HepG2和Huh-7人HCC细胞系用于功能验证。
- 2.
分子生物学技术：Western blot检测蛋白表达；流式细胞术分析CD86/CD206阳性巨噬细胞比例及吞噬功能；免疫荧光染色评估LC3B自噬标志物；qRT-PCR检测mRNA水平；质粒转染实现LIF过表达。
- 3.
体内实验：C57BL/6小鼠皮下接种H22鼠肝癌细胞建立荷瘤模型，腹腔注射SH（30 mg/kg/d）连续21天，监测肿瘤体积和体重，终点取肿瘤组织进行免疫组化（Ki-67、CD206、CD86）和Western blot分析。
- 4.
生物信息学分析：基于TCGA-LIHC数据库（367例HCC转录组数据），采用CIBERSORT计算22种免疫细胞亚群比例，limma筛选差异基因，clusterProfiler进行KEGG富集分析，GSVA计算HALLMARK通路评分，Kaplan-Meier曲线评估LIF表达与无复发生存的关系（GSE54236队列）。
研究结果
2.1 SH促进M1样极化：SH在100 μM安全浓度下增加M1型标志物（TNF-α、COX-2、IL-6、iNOS）蛋白水平，提高CD86阳性巨噬细胞比例，并显著增强NO产生。
2.2 SH抑制M2型巨噬细胞极化：SH降低M2型标志物（TGF-β、IL-10、Arg-1）蛋白和mRNA水平，减少CD206阳性细胞比例。
2.3 SH抑制M2相关自噬并增强巨噬细胞对HCC细胞的吞噬：SH降低ATG12和LC3B表达、恢复P62水平，免疫荧光证实LC3B荧光强度下降；吞噬实验显示SH处理使RAW264.7和THP-1细胞吞噬GFP标记HCC细胞的比例分别从5.78%升至22.22%、从8.83%升至25.58%。
2.4 SH处理的M2巨噬细胞抑制HCC细胞增殖、迁移和EMT：M2条件培养基促进HepG2和Huh-7细胞克隆形成和迁移，而上皮间充质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）标志物Vimentin和N-cadherin升高、E-cadherin降低；SH处理后的条件培养基逆转上述促肿瘤效应。
2.5 LIF高表达HCC的特征为M2巨噬细胞富集和PI3K-Akt激活：基于TCGA数据的免疫浸润分析显示LIF高表达组M2型巨噬细胞比例显著升高，KEGG富集分析发现PI3K-Akt信号通路最为显著，GSEA确认PI3K-Akt通路异常激活。
2.6 SH通过LIF/PI3K/AKT通路抑制M2极化：M2诱导上调LIF表达并激活PI3K/Akt磷酸化，SH处理后LIF表达及p-PI3K、p-Akt水平均下降；LIF过表达部分抵消SH对p-PI3K的抑制作用，并呈趋势性减弱SH对LC3B、TGF-β和IL-10的下调。
2.7 SH通过重塑TIME在体内抑制HCC生长：SH（30 mg/kg）显著减小肿瘤体积和重量而不影响体重，免疫组化显示Ki-67阳性和CD206表达降低、CD86升高，Western blot证实LIF、p-PI3K/PI3K比值、N-Cad、TGF-β和Arg-1下降，P62和NO升高。
讨论与结论
讨论部分指出，HCC进展不仅受肿瘤细胞内在恶性特性驱动，也受TIME中免疫细胞景观的调控。SH在非细胞毒性浓度下直接促进M1极化并抑制M2极化，其条件培养基逆转了M2巨噬细胞对HCC细胞增殖、迁移和EMT的促进作用，表明SH兼具直接抑制HCC细胞EMT和间接消除TAM介导的促转移效应的双重干预作用。机制上，SH抑制M2相关自噬并增强吞噬功能，同时通过抑制LIF/PI3K/Akt信号通路介导巨噬细胞重编程。研究还讨论了SH双向免疫调节特性：在过度炎症环境下抑制炎症反应恢复稳态，而在免疫抑制性肿瘤微环境中则促使M2型TAM向抗肿瘤M1型转变。此外，结合已有报道，水苏碱在不同肿瘤类型中均可抑制M2极化，但涉及的具体信号通路可能因肿瘤微环境而异。研究局限性包括：仅限于RAW264.7和THP-1细胞系、缺乏原代巨噬细胞验证；自噬结论基于标志物表达而未进行通量分析或药理挽救实验；LIF过表达实验缺少空载体对照和M2极化条件对照，因果关系尚需完善；皮下肿瘤模型不能完全模拟肝脏微环境。
结论：SH通过重编程巨噬细胞极化抑制HCC进展。SH促进M1样活化，增强CD86表达、NO产生和巨噬细胞对HCC细胞的吞噬；同时通过下调TGF-β、IL-10、Arg-1和CD206抑制M2极化。机制上，SH抑制M2相关自噬并减弱LIF/PI3K/Akt信号通路。但由于挽救实验未达到统计学显著性，该通路的因果必要性仍有待确定。功能上，SH处理的巨噬细胞减少HCC细胞增殖、迁移和EMT，SH在体内抑制肿瘤生长并将肿瘤浸润巨噬细胞重塑为抗肿瘤表型。这些发现表明SH是一种针对巨噬细胞极化的HCC免疫调节治疗的有前景的候选药物。
