《International Journal of Molecular Sciences》：Tryptophan and Its Selected Metabolites Modulate Melanoma-Cell Biology: A Preliminary In Vitro Study
编辑推荐：
色氨酸（TRP）及其代谢物参与皮肤内众多生理与病理过程，可能影响黑色素瘤生物学行为，但其作用仍认识不足。本研究在体外探究色氨酸（TRP）、邻氨基苯甲酸（AA）与朱砂精酸（CBA）对黑色素瘤细胞的作用及其与B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶（BRAF）抑制剂维
色氨酸（TRP）及其代谢物参与皮肤内众多生理与病理过程，可能影响黑色素瘤生物学行为，但其作用仍认识不足。本研究在体外探究色氨酸（TRP）、邻氨基苯甲酸（AA）与朱砂精酸（CBA）对黑色素瘤细胞的作用及其与B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶（BRAF）抑制剂维莫非尼的潜在相互作用。研究采用A375、G361与SK-MEL-3黑色素瘤细胞系及THP-1来源巨噬细胞模型。细胞增殖与代谢活性以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）法评估，迁移以划痕实验评估，细胞周期分布以流式细胞术检测。Western blotting用于分析选定信号蛋白。活性氧（ROS）与一氧化氮（NO）生成亦被评估。生物信息学分析探究BRAF与色氨酸代谢及犬尿氨酸通路相关基因间的关联。所有化合物均呈剂量依赖性抗增殖效应，延长暴露可增强效力。TRP与AA增加G0/G1期细胞周期阻滞，而CBA增加G2/M期细胞群。TRP还降低A375细胞迁移。三种化合物均增强维莫非尼的抗增殖效应，其中CBA作用最强（约20%）。Western blot分析提示p21表达与ERK1/2磷酸化受到调控，提示其涉及细胞周期与应激信号通路。此外，暴露于受试样品的A375细胞条件培养基影响THP-1来源巨噬细胞的细胞活力、ROS与NO生成。TRP及其代谢物可被视为黑色素瘤BRAF靶向治疗的潜在辅助剂。然而，仍需进一步体内研究以明确其治疗价值并阐明潜在分子机制。
研究背景与问题
色氨酸（TRP）及其生物活性代谢物在皮肤生理与病理过程中的作用尚未被充分阐明。皮肤持续暴露于内源性和外源性TRP衍生物来源，角质层中的氨基酸可被皮肤微生物群作为TRP代谢底物，TRP代谢物亦存在于人汗液及用于身体护理的草本或植物提取物中。约95%的TRP经犬尿氨酸通路（KP）代谢，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及多种生物活性代谢物。TRP及其代谢物在癌变与转移中的作用尚不完全清楚，既往研究主要集中于免疫调节，但其亦可能影响癌细胞增殖、存活或迁移。
黑色素瘤以高转移潜能和内在抗药性为特征。BRAF抑制剂（如维莫非尼）是黑色素瘤靶向治疗的重要类别，约50%黑色素瘤可检出BRAF突变，但单药治疗可导致耐药。免疫检查点阻断剂（ICB）虽已获批用于晚期黑色素瘤，但抗PD1抗体应答率通常低于40%，提示存在免疫逃逸与耐药机制。Elmer等揭示了由Hedgehog/GLI（HH/GLI）与促炎IL6/STAT3或IFNγ/STAT1信号协同激活驱动的新型免疫抑制机制，其共同增强吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）表达。IDO1上调通过三种关键机制诱导免疫抑制、肿瘤增殖、侵袭与迁移：诱导免疫抑制性抗原呈递细胞；耗竭TRP并蓄积KP代谢物，激活芳香烃受体（AhR）等通路，导致T细胞凋亡与Th17抑制；招募髓源性抑制细胞（MDSCs）增强免疫抑制性肿瘤微环境。黑色素瘤患者血清与肿瘤微环境中可见犬尿氨酸（KYN）水平升高，与预后不良及免疫治疗耐药相关，因此靶向KP正被探索为黑色素瘤治疗策略。研究人员既往研究揭示了犬尿喹啉酸（KYNA）、KYN与6-甲酰基吲哚[3,2-b]咔唑（FICZ）在体外黑色素瘤细胞中的生物活性。因此本研究旨在确定TRP及其选定代谢物邻氨基苯甲酸（AA）与朱砂精酸（CBA）是否在体外影响黑色素瘤细胞增殖、迁移与细胞周期，并鉴定TRP、AA、CBA与BRAF抑制剂维莫非尼在黑色素瘤—免疫细胞相互作用体外模型中的生物学相互作用，以验证TRP及其代谢物作为黑色素瘤治疗辅助剂的潜力。
主要技术方法
研究采用A375、G361与SK-MEL-3黑色素瘤细胞系（A375与G361代表原发黑色素瘤，SK-MEL-3代表转移性黑色素瘤）及经佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）诱导分化的THP-1来源巨噬细胞模型；以MTT法评估增殖与代谢活性，划痕实验评估迁移，流式细胞术结合碘化丙啶染色评估细胞周期，Western blotting检测p21、p53、磷酸化ERK1/2及总ERK1/2蛋白，并以DCF-DA与DAF-FM DA分别检测ROS与NO；同时利用STRING数据库构建蛋白—蛋白相互作用网络，并以GEPIA2基于癌症基因组图谱（TCGA）皮肤 cutaneous 黑色素瘤数据分析BRAF与KP基因表达的相关性。细胞系来源为美国典型培养物保藏中心（ATCC）与欧洲认证细胞培养物保藏中心（ECACC）。
研究结果
- 2.
Results
TRP与AA、CBA对黑色素瘤细胞增殖与代谢活性的影响：MTT法显示，TRP在24与96 h均抑制全部黑色素瘤细胞系增殖与代谢活性，且呈浓度与时间依赖性；24 h时1 mM与5 mM TRP对A375抑制14.2%与63.6%，对G361抑制21.4%与90.7%，对SK-MEL-3抑制28.8%与90.6%；96 h抑制作用增强，5 mM时各细胞系抑制率达98%—100%。AA对A375抑制作用最强，24 h时1 nM至5 mM抑制6.4%至29.9%，24 h对G361无影响，5 mM对SK-MEL-3抑制17.5%；96 h时AA抑制全部细胞系。CBA在100 μM时24 h对A375、G361、SK-MEL-3分别抑制51%、71.4%、79.6%，且呈时间依赖性，100 μM时对G361抑制99.9%。基于上述结果及A375细胞系特性，选择A375进行后续研究。
TRP及其代谢物对A375细胞周期进程的影响：流式细胞术显示，TRP显著增加G0/G1期细胞比例（1 mM增加7.56%，5 mM增加5.91%），并降低G2/M期细胞数；AA 1 mM增加G0/G1期6.73%并降低G2/M期6.21%；CBA 1 μM降低G0/G1期9.11%并增加G2/M期6.57%。
对细胞周期调控蛋白与ERK1/2活化的影响：Western blotting显示，所有受试物均影响细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21蛋白水平，且呈物质与浓度依赖性；最高浓度TRP显著降低p21水平并增加ERK1/2磷酸化，AA增加p21水平与ERK1/2活化，CBA 100 μM显著增加p21水平；未观察到TRP、AA、CBA对p53蛋白表达的影响。
对A375细胞迁移的影响：划痕实验显示，毫摩尔浓度TRP在24 h抑制A375细胞迁移，而AA与CBA未见显著作用。
生物信息学分析：STRING数据库显示BRAF与TRP代谢及KP基因（IDO1、IDO2、TDO2、KYAT1、AADAT、KYAT3、GOT2、AFMID、KYNU、KMO、ACMSD）、转运体与受体（SLC7A5、SLC3A2、SLC7A8、SLC36A4、GPR35）、细胞周期调控因子（TP53、CDKN1A）及信号通路（KSR1、KSR2、MAP2K2、MAP3K11）存在功能相互作用；富集分析显示氨基酸代谢相关基因显著过表达，犬尿氨酸代谢过程高度富集。GEPIA2数据显示BRAF表达与TDO2、KYNU及所有编码犬尿氨酸氨基转移酶（KATs）的基因（KYAT1、AADAT、KYAT3、GOT2）呈统计学显著相关，但Spearman相关系数提示关联较弱。
与维莫非尼的相互作用：MTT法显示，TRP（1 mM）、AA（1 mM）与CBA（100 μM）均增强维莫非尼（10 μM）对A375细胞的抑制活性，CBA作用最强，24 h增强20.26%，TRP与AA分别增强11.84%与10.21%。细胞周期分析显示，维莫非尼（10 μM）使A375细胞阻滞于G0/G1期并降低S与G2/M期细胞数；TRP与AA不影响维莫非尼的细胞周期抑制作用，而CBA与维莫非尼共孵育降低G0/G1期细胞群并增加S与G2/M期细胞数。
对巨噬细胞的影响：以A375条件培养基（CM）处理PMA诱导的THP-1巨噬细胞，CM本身不影响巨噬细胞活力与代谢活性；CM-Vemurafenib/TRP与CM-Vemurafenib在24 h增加巨噬细胞代谢活性；CM-Vemurafenib/CBA在24 h增加巨噬细胞活力与代谢活性，且与CM-Vemurafenib及CM-CBA相比具统计学显著性。48 h时CM-TRP及CM-TRP/维莫非尼降低巨噬细胞活力；96 h时CM-维莫非尼及CM-维莫非尼/TRP降低巨噬细胞活力。ROS检测显示，CM-Vemurafenib/CBA在24 h显著抑制巨噬细胞ROS生成；48 h时CM-维莫非尼/TRP、CM-维莫非尼/AA与CM-维莫非尼/CBA降低ROS生成，96 h无显著效应。NO检测显示，CM-A375在48 h呈增强NO生成趋势；24 h时CM-Vemurafenib/TRP与CM-Vemurafenib/CBA抑制NO生成，CM-TRP与CM-AA增加NO生成；CM-CBA在24 h抑制NO生成，而48与96 h呈相反效应。TRP、AA、CBA在受试浓度范围内不降低巨噬细胞活力，亦不影响巨噬细胞ROS与NO生成，提示效应由A375细胞分泌组改变介导。
讨论与结论
讨论指出，本研究首次证实TRP、AA、CBA与黑色素瘤A375、G361、SK-MEL-3细胞的直接相互作用。所用细胞系均携带BRAF（V600E）突变，仅SK-MEL-3缺乏功能性TP53。TRP的抑制作用随时间增强，96 h时各细胞系抑制率超过98%；MTT法结果应视为细胞增殖、活力、代谢活性与生长阶段等多种生物活性的总和。TRP诱导G0/G1期阻滞，5 mM TRP激活ERK1/2应解释为细胞对胁迫信号的应答。AA的抗增殖活性明显低于TRP与CBA，其机制可能源于p21上调，而ERK通路持续激活可诱导p21表达增强；AA衍生物生物活性广泛，涉及醛酮还原酶、Hedgehog与MAPK5信号通路。CBA为3-羟基邻氨基苯甲酸自发氧化产物，被视为AhR配体，其抗增殖活性可能源于抑制线粒体呼吸，且对细胞存活的影响可能依赖细胞类型与暴露时间。生物信息学分析揭示BRAF与KP及细胞周期调控因子的相互作用，p21（由CDKN1A编码）被视为黑色素瘤患者的预测性生物标志物，p53激活可能通过p21上调提高BRAF抑制剂疗效。TRP、AA、CBA增加ERK1/2磷酸化但未刺激癌细胞增殖，提示ERK激活可能源于细胞应激。与维莫非尼共孵育时，AA与CBA的抗增殖活性与p21水平升高相关，而TRP虽增强维莫非尼活性却未上调p21，提示不同分子机制；TRP与AA不改变维莫非尼的细胞周期阻滞作用，提示其协同抑制可能源于额外代谢机制。研究强调癌细胞与免疫细胞形成复杂微环境网络，肿瘤微环境中TRP等必需营养物减少是癌症标志之一，TRP及其代谢物可能是癌细胞与肿瘤微环境间的代谢信号生物标志物。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境主要免疫成分，与不良临床结局相关；本研究显示CM-A375不影响巨噬细胞活力，CM-CBA增加巨噬细胞活力应解释为代谢活性增加而非增殖，因PMA活化后THP-1细胞丧失增殖能力，提示CBA与TRP、AA作用机制不同，可能因其为KP终产物之一。结果提示TRP及其代谢物改变A375细胞分泌组分谱而非直接作用于巨噬细胞。IDO1在多种癌症（包括黑色素瘤）中过表达，其上调与TRP/KYN比值降低与患者生存期显著缩短相关，但IDO1抑制剂临床试验未取得突破。TRP可经核糖体移码影响黑色素瘤细胞mRNA翻译，呈递异常移码肽；TRP亦通过上调肿瘤浸润淋巴细胞与黑色素瘤细胞中IDO1与TDO改变肿瘤微环境免疫谱，TRP水平降低导致免疫抑制性Tregs激活与细胞毒性T细胞饥饿，黑色素瘤免疫逃逸亦受KYN依赖性AhR激活调控。ROS在癌症中具双重作用，NO在黑色素瘤进展中作用复杂，低浓度促进肿瘤增殖而高浓度具细胞毒性。研究指出，鉴于部分KP酶的非选择性及其参与其他生物反应，所指示的相关性需进一步研究验证KP激活是否为黑色素瘤的防御与调控机制之一；KP代谢物可能在肿瘤细胞及其环境的转录组与代谢水平发挥作用，TRP、其代谢物与KP基因在癌细胞、肿瘤微环境与免疫系统间的复杂代谢与转录组平衡而非单个基因或代谢物，可能对理解该氨基酸在癌症发生、进展与转移中的作用至关重要。本研究在携带BRAF（c.1799 T > A）与CDKN2A（c.181G > T）突变的A375细胞中进行，CDKN2A是黑色素瘤中最常失活的抑癌基因，但约25%黑色素瘤BRAF突变位于基因序列不同位置，故现阶段难以明确TRP及其代谢物抑制黑色素瘤细胞的分子机制。既往研究证实A375细胞存在编码KP酶的选定基因及KYNA与AA生成，提示KP在这些细胞中具有活性，因此不能排除TRP及代谢物通过复杂通路发挥作用；外源性给予KP产物或底物可能扰乱酶反应动力学，导致细胞代谢稳态显著改变。值得注意的是，本研究中TRP、AA、CBA的抗增殖活性见于较高浓度；既往研究显示人血浆中TRP浓度为54.40 μM至66.8 μM，AA为12.1 nM至18.35 nM，CBA为250 pM至11,750 pM；仅1 μM TRP（低于生理血清浓度）在96 h孵育后对A375增殖呈抑制作用，而在生理血清TRP浓度范围内未观察到对细胞周期、迁移或蛋白表达的显著影响。尽管皮肤中受试代谢物浓度数据有限，达到足够高血清水平似乎是其用于抗癌治疗的限制因素，但直接局部皮肤给药可实现高局部浓度并显著减少对正常皮肤细胞非特异性效应。研究强调，细胞水平观察到的抑制作用可能源于转录组与代谢水平的复杂依赖网络而非与单一蛋白的简单相互作用；采用单一细胞系虽具稳定遗传环境优势，但仍是研究局限且缺乏系统复杂性，需更复杂的体外与体内模型以全面理解TRP及其代谢物的毒理学特征与免疫调节作用。
研究结论：TRP及其代谢物可被视为黑色素瘤BRAF靶向治疗的潜在辅助剂，但需进一步体内研究以明确其治疗价值并阐明潜在分子机制。
