缺氧相关糖酵解-脂质合成重编程与抗原呈递受损：卵巢癌SPP1+肿瘤相关巨噬细胞的功能状态解析

《International Journal of Molecular Sciences》：Hypoxia-Associated Glycolytic–Lipogenic Reprogramming and Impaired Antigen Presentation in SPP1+ Tumor-Associated Macrophages in Ovarian Cancer

　　

卵巢癌具有免疫抑制性微环境，其中SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）与不良预后和免疫逃逸相关，但其分子特征和代谢机制仍不清楚。因此，研究人员着手确定SPP1是否标记治疗初治高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）中一个离散的TAM亚群或一种功能状态，定义伴随的转录和代谢程序，并检验局部缺氧是否与之相关。来自三个单细胞数据集（每例患者一个病灶；47例患者）的肿瘤源性治疗初治样本产生385,504个细胞；使用Seurat v5和Harmony进行聚类、注释和批次校正。通过差异表达、GO/KEGG/GSEA、代谢评分和转录因子推断比较SPP1⁺/SPP1^?巨噬细胞，并使用样本内SPP1高表达与低表达比较以及由两种独立算法评分的MSigDB Hallmark基因集重新检验该定义。验证使用Visium空间转录组学（GSE263920）、TCGA-OV（n = 429）、CD8⁺ T细胞耗竭分析、CellChat和同基因ID8模型。在64,067个巨噬细胞（16.62%）中，82.0%为SPP1⁺；上调基因富集于糖酵解、单核细胞迁移和组织重塑，而MHC II类和中性粒细胞相关基因下调。在样本水平，糖酵解、脂肪酸合成和谷氨酰胺分解评分升高，胆固醇合成评分降低，无脂肪酸氧化或氧化磷酸化受抑制的证据；HIF1A在271个转录因子中排名第4，NR1H3排名第3。所有8个空间切片均显示缺氧-SPP1正相关，热点区显示糖酵解、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、免疫抑制和巨噬细胞评分升高。未发现SPP1⁺ TAM浸润与CD8⁺ T细胞耗竭之间的稳健关联（p = 0.315）。MDK–LRP1/SDC1是主要的巨噬细胞定向输入。免疫荧光显示，在ID8肿瘤的HIF1α丰富区域内，部分CD68⁺巨噬细胞中有SPP1免疫反应性，无CD8⁺PD-1⁺ T细胞聚集。因此，SPP1⁺ TAMs对应一种缺氧功能状态，具有HIF1A激活、糖酵解-脂质合成转录程序、胆固醇合成基因表达降低和MHC II类程序降低；蛋白质水平和功能验证以及HIF1A依赖性的直接测试仍是必要的。

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，尽管采用肿瘤细胞减灭术联合铂类化疗，晚期患者5年生存率仍低于40%，免疫检查点阻断治疗的有效率仅10%–15%，这与卵巢癌“冷肿瘤”免疫表型密切相关。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是卵巢癌微环境中最丰富的免疫细胞之一，其中SPP1⁺ TAMs在多种实体瘤中被鉴定为与不良预后、化疗耐药和免疫抑制相关的促肿瘤亚群。然而，SPP1⁺ TAMs在卵巢癌中的详细分子特征、代谢重编程机制和空间分布模式尚不完全清楚，现有研究多局限于单一数据集或单一分析层面。因此，本研究旨在回答三个问题：SPP1是否标记一个离散的TAM亚群还是一种连续的功能状态；伴随该状态的转录和代谢程序是什么；局部缺氧是否与之相关。

研究人员整合了三个公共单细胞数据集（GSE184880、GSE222556、GSE241221）中的治疗初治肿瘤样本，每例患者仅保留一个病灶，共47例患者385,504个细胞，构建了治疗初治高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）的单细胞图谱。通过差异表达、基因本体（Gene Ontology，GO）/京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）/基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）、代谢评分和转录因子推断，比较SPP1⁺与SPP1^?巨噬细胞；采用样本内高/低SPP1比较和两种独立算法评分的MSigDB Hallmark基因集重新检验定义的稳健性。验证分析利用了Visium空间转录组学（GSE263920）、TCGA-OV队列（n=429）、CD8⁺ T细胞耗竭分析、CellChat细胞通讯推断和同基因ID8小鼠模型。研究发现SPP1⁺ TAMs对应一种缺氧相关的功能状态，具有HIF1A激活、糖酵解-脂质合成转录程序、胆固醇合成基因表达降低和MHC II类程序降低的特征，但蛋白质水平和功能验证仍属必要。

关键技术方法：数据来源于三个GEO单细胞数据集（47例治疗初治HGSOC肿瘤样本）和GSE263920的8个Visium空间转录组切片，以及TCGA-OV（429例）和ID8小鼠模型。主要方法包括：Seurat v5和Harmony进行聚类、注释和批次校正；Wilcoxon秩和检验和edgeR进行差异表达；clusterProfiler进行GO/KEGG富集，fgsea进行GSEA；AddModuleScore和AUCell进行代谢通路评分；dorothea/decoupleR推断转录因子活性；样本内SPP1高/低比较验证定义；空间热点-冷点比较；CellChat推断细胞通讯；多重免疫荧光检测。

研究结果如下：

2.1 治疗初治卵巢癌样本单细胞图谱的构建：整合三个数据集，经适应性质量控制后保留385,504个细胞，鉴定出T细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、NK细胞、B细胞和内皮细胞7种细胞类型，其中巨噬细胞占16.62%。

2.2 巨噬细胞亚群结构与SPP1表达图谱：提取64,067个巨噬细胞重新聚类为18个亚群；以SPP1>0为阈值，SPP1阳性率为81.96%，但SPP1⁺细胞广泛分布于各亚群（28.98%–100.0%），提示SPP1是功能状态而非离散亚群。

2.3 SPP1定义的稳健性：采用样本内SPP1高/低三分位比较，重现了参考定义下69.7%的上调基因和59.3%的下调基因，代谢差异方向保持一致，表明结果不依赖于特定阈值。

2.4 SPP1⁺ TAMs的分子和功能特征：上调基因富集于糖酵解（SLC2A1、HK2、PKM、LDHA）、单核细胞迁移和组织重塑（HTRA1、PDPN、CTSK等）及脂质代谢（LPL、SCD、APOC1、FABP5）；下调基因包括中性粒细胞相关基因（S100A8/A9/A12、SELL）和MHC II类基因（HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74）及其调控因子CIITA。

2.5 SPP1⁺ TAMs的代谢重编程特征：样本水平上，糖酵解和脂肪酸合成评分在47/47个样本中升高，谷氨酰胺分解评分在31/47中升高，胆固醇合成评分在41/47中降低，脂肪酸氧化和氧化磷酸化未见抑制。

2.6 精选基因集和独立评分确认转录表型：MSigDB Hallmark和AUCell两种算法在7/10个基因集方向上一致，但包含外排基因的胆固醇组合集和包含溶酶体蛋白酶的抗原处理集合出现方向差异，说明组合评分对基因集构成敏感。

2.7 SPP1⁺ TAMs的转录调控网络：271个转录因子中，HIF1A活性排名第4，其靶基因BNIP3、SLC2A1、ENO2、PLOD2同步上调，KEGG HIF-1通路富集；NR1H3（LXRα）排名第3，与胆固醇合成抑制一致；PPARG排名第105，不支持其为核心调控因子。

2.8 SPP1⁺ TAMs的空间定位和微环境特征：在8个Visium切片中，SPP1⁺ TAM签名热点与缺氧评分的空间高值区对应，所有8个切片中热点区缺氧评分升高（中位Spearman r=0.344）；以切片为统计单位，热点区糖酵解、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、免疫抑制和巨噬细胞评分在8/8个切片中升高。

2.9 SPP1⁺ TAM浸润与CD8⁺ T细胞耗竭的关系：以样本为推断单位，SPP1⁺ TAM高浸润组与低浸润组的CD8⁺ T细胞耗竭评分无显著差异（p=0.315），剂量-效应分析也无关联（Spearman r=?0.059，p=0.691），提示在治疗初治样本中二者无稳健关联。

2.10 细胞间通讯网络：CellChat分析显示，成纤维细胞来源的COLLAGEN信号和上皮来源的MIF信号强度最高；巨噬细胞方向的主要输入是MDK–LRP1，而COL1A1/COL1A2/COL6A1/A2/A3–SDC1构成连续的基质输入组。

2.11 缺氧-SPP1关联的多水平验证：单细胞水平巨噬细胞缺氧评分与SPP1表达正相关（r=0.134，p<2.2×10^?16）；空间水平所有8个切片正相关（符号检验p=0.0078）；TCGA-OV中SPP1表达与缺氧评分正相关（r=0.203，p=2.28×10^?5）。方向一致，但观察性数据不能确立因果关系。

2.12 体内验证：在同基因ID8皮下肿瘤中，多重免疫荧光显示HIF1α丰富区域内有部分CD68⁺巨噬细胞呈SPP1免疫阳性，且CD206⁺细胞存在于同一视野；未观察到CD8⁺PD-1⁺ T细胞聚集。该结果仅为描述性。

讨论部分总结：本研究将SPP1⁺ TAMs定义为缺氧相关的功能状态，而非离散亚群，其代谢特征不符合经典M1/M2二分法；HIF1A和NR1H3可能是关键转录调控因子；SPP1⁺ TAMs的免疫抑制作用可能具有空间性而非系统性。研究存在转录组推断、观察性设计和阈值依赖性等局限性。

结论部分翻译：本研究在单细胞、组织空间和患者水平表征了治疗初治卵巢癌中SPP1⁺ TAMs的分子特征和功能表型。主要结论如下：（1）SPP1标记巨噬细胞的连续功能状态而非离散亚群——SPP1⁺细胞分布于所有18个巨噬细胞亚群，阳性率取决于表达阈值和测序深度，分子差异通过样本内高/低比较得到重现；（2）在转录水平上，该状态伴随糖酵解增加、脂质摄取和合成基因表达增加以及胆固醇合成基因表达降低，这一组合不符合经典M1/M2二分法，在蛋白质和通量水平确认之前不能描述为代谢重编程；（3）HIF1A活性及其下游程序上调，缺氧与SPP1在单细胞、空间和TCGA水平均呈正相关（所有8个切片），将缺氧-HIF1A轴确定为候选上游调控因子，但仍属关联而非因果；（4）该状态同时显示MHC II类基因和CIITA的协同下调，与抗原呈递程序降低一致；由于未测量表面蛋白和功能呈递，抗原呈递受损仍是待验证的假设而非已证实的免疫逃逸机制；（5）将分析限制在治疗初治样本后，未观察到SPP1⁺ TAM浸润与CD8⁺ T细胞耗竭之间的稳健关联，提示既往结论可能受治疗暴露混杂。