重复性压缩载荷对人软骨下骨成骨细胞自噬相关因子表达、自噬能力及细胞活性的影响

《International Journal of Molecular Sciences》：Effects of Repetitive Compressive Loading on the Expression of Autophagy-Related Factors, Autophagy Capacity and Cellular Activity in Human Subchondral Bone Osteoblasts

　　

已知骨代谢会随机械应力而改变。在骨关节炎（osteoarthritis, OA）中，软骨下骨与关节软骨层均受机械应力损伤，进而对整体关节的力学环境与稳态平衡产生不利影响，导致OA发生。然而，机械应力对软骨下骨成骨细胞的影响，尤其是其对压力的防御机制，仍不明确。本研究聚焦于软骨下骨成骨细胞的机械应力应答能力，此类细胞与软骨层中的软骨细胞一样，经常性暴露于重复性机械应力之下。本研究旨在确定重复性机械力（生理水平的循环压缩载荷）是否影响软骨下骨成骨细胞中自噬调控因子的表达、自噬能力及细胞活性。研究人员利用胶原海绵支架，由人软骨下骨成骨细胞构建三维培养组织，并对三维细胞培养构建体施加重复性压缩载荷。在对三维细胞–胶原海绵构建体施加机械载荷后，研究人员比较分析了人成骨细胞中自噬相关因子（ATG5、Beclin-1、Parkin）的表达，同时分析了成骨细胞分化活性（碱性磷酸酶）水平，并采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）检测有无重复性压缩载荷条件下的自噬过程。在早期和成熟成骨细胞中，与无载荷组相比，重复性压缩载荷均降低了自噬相关因子ATG5、Beclin-1和Parkin的表达，提示重复性压缩载荷可能诱导软骨下骨成骨细胞中细胞自噬及线粒体自噬的下调。TEM分析表明，在无载荷组的早期和成熟成骨细胞中，自噬过程均在进行；相反，重复性载荷减少了成熟和早期成骨细胞中自噬体与自噬溶酶体的数量。研究结果表明，重复性机械载荷导致早期和成熟成骨细胞的细胞自噬与线粒体自噬均减少，同时诱导成骨细胞分化。机械应力在促进成骨细胞分化的同时，也改变了作为细胞防御机制的自噬，提示在持续重复性载荷条件下，对维持细胞内稳态至关重要的自噬应答改变与适应性骨形成应答同时发生，可能长期影响成骨细胞功能。研究数据表明，即使处于生理水平，重复性机械应力所引起的线粒体自噬与细胞自噬减少，也可能导致细胞内缺陷线粒体和异常细胞蛋白的蓄积，从而降低成骨细胞活性并影响软骨下骨组织稳态，最终促进OA进展。

研究背景：在现代老龄化社会中，骨质疏松、脆性骨折及骨关节炎（osteoarthritis, OA）等年龄相关骨软骨疾病发病率快速上升，造成显著的患者病残率与长期卧床率。OA是以进行性软骨降解、继发性滑膜炎及软骨下骨重塑为特征的退行性关节疾病，可导致慢性疼痛与活动能力丧失。近年来，软骨下骨退变对OA进展的病理学贡献已获广泛认可；与对关节软骨的损伤作用类似，慢性重复性机械应变作用于软骨下骨成骨细胞，是骨软骨退变的主要驱动因素之一。骨转换持续适应多种内外环境应激因素，其中机械载荷是骨组织代谢的基本调控因素。在细胞层面，包埋于骨陷窝–骨小管网络中的骨细胞通过树突突起与骨表面成骨细胞直接相互作用，主要经经典Wnt信号通路调控成骨性骨形成能力；骨细胞感受机械应变后下调硬化素（sclerostin）这一内源性Wnt拮抗剂的表达与分泌，解除Wnt抑制从而促进成骨细胞分化、活性及基质矿化。除骨细胞介导的调控外，成骨细胞亦具备细胞自主的机械感受机制；研究人员既往证实，机械应变作用于成骨细胞可激活细胞膜葡萄糖转运体1（glucose transporter 1, Glut1），驱动细胞内葡萄糖摄取，进而抑制线粒体去乙酰化酶Sirtuin 1（SIRT1），解除其对成骨主转录因子Runx2的抑制，加速成骨细胞分化、成熟与基质合成能力。然而，成骨细胞如何在缺乏骨细胞树突网络的情况下直接感知机械应变并维持细胞完整性，尤其是软骨下骨中内在的保护性防御机制，仍不完全清楚。细胞依赖巨自噬（macroautophagy，以下称自噬）作为应对环境应激的关键稳态防御机制，通过隔离并循环利用必要胞质成分、清除毒性蛋白聚集体与受损细胞器维持细胞代谢平衡，自噬功能障碍则导致线粒体衰退、细胞衰老及多种年龄相关病理改变。自噬的细胞器质量控制功能已在OA发病中的关节软骨细胞中得到广泛研究，与健康对照相比，骨关节炎软骨细胞中自噬流受损已有充分文献记载，直接将自噬失败与基质降解及关节衰竭相关联；值得注意的是，研究人员近期研究发现重复性机械载荷抑制人软骨细胞中关键自噬调控因子，损害细胞活性并促进软骨破坏。同时，软骨下骨退变日益被认为是OA发展的主动 contributing 因素，软骨下骨板与骨小梁同覆盖其上的关节软骨构成功能耦联的骨软骨单元，共同维持生物力学缓冲与关节稳态；病理性或重复性机械载荷破坏该功能单元，加速骨软骨降解与OA临床发生。软骨下骨细胞（包括成骨细胞与骨细胞）很可能依赖自噬保护以对抗应激诱导的细胞器损伤与代谢衰退，软骨下骨成骨细胞可能发生类似于研究人员在关节软骨细胞中发现的机械应激诱导的自噬改变；然而，重复性机械应激是否直接损害软骨下骨成骨细胞的自噬能力，导致功能障碍性线粒体蓄积与软骨下骨代谢功能障碍，尚未被阐明。自噬核心分子通路涉及高度保守的调控蛋白：自噬相关蛋白5（autophagy-related protein 5, ATG5）对自噬体膜延伸不可或缺，并参与细胞骨架重组与凋亡信号；Beclin-1通过与Vps34及Vps15形成复合物激活III类磷脂酰肌醇3-激酶活性，是自噬诱导的必要启动因子；与ATG5和Beclin-1不同，E3泛素连接酶Parkin特异性调控线粒体自噬，线粒体去极化后Parkin转位至线粒体外膜，泛素化靶向外膜蛋白以招募蛋白酶体与自噬机器清除缺陷细胞器。研究人员假设：在软骨下骨层，重复性机械载荷下调成骨细胞的细胞自噬与Parkin介导的线粒体自噬，导致受损线粒体与缺陷蛋白聚集体在细胞内蓄积，损害成骨细胞功能活性与软骨下骨健康，最终驱动OA中的骨软骨退变；为验证该假设，研究人员采用受循环压缩载荷的三维成骨细胞–胶原培养模型，评估重复性机械应激如何影响人软骨下骨成骨细胞的自噬能力及ATG5、Beclin-1和Parkin的表达。研究意义在于，阐明骨与软骨适应机械应变的细胞机制是发现骨质疏松与OA等年龄相关肌骨疾病新治疗靶点的基础，而明确软骨下骨成骨细胞对抗机械应激的自我保护机制具有重要病理生理学意义。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用商业来源的人软骨下骨成骨细胞（源自64岁白人女性髋关节供者，PromoCell GmbH），经成骨生长培养基扩增及成骨矿化培养基诱导，分别于第7–9天收集早期成骨细胞、第22–23天收集成熟成骨细胞，并以三个独立生物学重复批次进行实验；伦理经圣玛丽安娜医科大学伦理委员会批准（批准号1315）。将细胞接种于多孔胶原海绵支架（直径5 mm×高3 mm，平均孔径约100 μm）构建三维细胞–胶原构建体。采用定制加载系统施加生理性循环压缩载荷（0 kPa静态对照或2.5 kPa，52次/分钟，即0.87 Hz，持续60或180分钟）。检测指标包括细胞内总蛋白提取与定量、Western blot检测Parkin、ATG5、Beclin-1（以β-actin为内参）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）比色法活性测定及TEM超微结构观察。

研究结果：（1）动态压缩的操作参数与系统表征：三维细胞–支架构建体置于含1.5 mL DMEM的12孔板中，采用定制压缩装置施加载荷；生理性循环载荷为0 kPa（无载荷基线）或2.5 kPa（25.5 gf/cm²），该强度不引起可检测的细胞损伤或凋亡，适用于后续全部实验；装置输出峰值2.5 kPa、0.87 Hz的正弦压缩波，内部压缩应变自百分之零点几至约1%，每一压缩周期1.15秒，与慢速行走或心脏驱动运动的单腿载荷节律相近，故采用52次/分钟（0.87 Hz）；该生理阈值内的压缩力经现有文献验证对骨关节组织构建体无细胞毒性；在15分钟至72小时各时间点连续监测扭矩输出、周期间一致性与冲程速度，系统变异严格低于0.5%；2.5–4.0 kPa压缩力对细胞活力无不良影响，与既往文献及CCK-8活力数据一致，静态培养对照与加载样本间CCK-8细胞活力无显著差异。单层扩增的软骨下骨成骨细胞以1.0×10⁶ cells/mL悬于DMEM，按1×10⁵ cells/scaffold/well接种于96孔板多孔胶原海绵，37 °C、95%空气/5% CO₂孵育过夜稳定后转入12孔板，施加0 kPa或2.5 kPa、52次/分钟、60或180分钟的动态压缩载荷。（2）压缩载荷后细胞蛋白产量的定量评估：60分钟动态加载使早期成骨细胞（* p < 0.05）与成熟成骨细胞（p = 0.064）三维构建体提取细胞蛋白含量呈短暂下降趋势；延长至180分钟时，早期（p = 0.341）与成熟（p = 0.179）成骨细胞细胞蛋白产量较无载荷对照均无显著降低；数据为每组三个独立细胞–胶原构建体的均值±标准差。（3）机械应变诱导成骨标志物ALP表达：60或180分钟循环压缩均显著提高早期与成熟成骨细胞中ALP（成骨细胞分化的关键功能标志物）表达（对照 vs 60分钟载荷：p < 0.01；对照 vs 180分钟载荷：p < 0.01；每次实验4个重复、共四次独立生物学运行），两种分化阶段中载荷诱导的ALP上调均呈时间依赖性，表明循环机械应激促进成骨细胞功能活性与成熟。（4）TEM超微结构评估自噬机器：静态对照条件下，早期与成熟成骨细胞均显示大量基线自噬结构，包括自噬体、初级溶酶体、自噬体–溶酶体融合囊泡及含部分消化细胞器的自噬溶酶体；60分钟压缩应变下，两种成熟阶段仍可观察到自噬细胞器（自噬体、溶酶体、自噬体–溶酶体融合体及自噬溶酶体），但总体频率较无载荷基线减少；与无载荷组及60分钟加载组相反，180分钟加载组的早期与成熟成骨细胞中极少观察到自噬体或自噬溶酶体；在成熟成骨细胞组（而非早期成骨细胞组）细胞内可见大量胶原纤维结构，提示180分钟载荷促进成熟成骨细胞骨胶原产生；与对照组相比，60分钟与180分钟加载队列每细胞这些细胞器（自噬体、溶酶体、自噬溶酶体）计数显著下降（* p < 0.05，** p < 0.01），而亚组间细胞器大小无显著差异；定量数据为每组3个独立构建体、每构建体分析3–4个细胞、每组共10个细胞，由三名对实验条件设盲的研究人员独立计数。（5）循环压缩力下ATG5自噬蛋白表达的调控：早期成骨细胞中ATG5蛋白表达在循环机械应变下呈下降趋势，180分钟压缩较静态对照显著下调ATG5信号强度（n = 3独立生物学运行；对照 vs 180分钟载荷：p < 0.01），60分钟应变虽未达统计学显著性，但ATG5蓄积减少趋势明显（对照 vs 60分钟载荷：p = 0.064）；成熟成骨细胞中重复性压缩载荷同样诱导ATG5表达下降，60分钟载荷较无载荷对照显著下调ATG5表达（对照 vs 60分钟载荷：p < 0.01），180分钟处理亦呈降低ATG5表达的趋势（对照 vs 180分钟载荷：p = 0.077）。（6）生理性重复性压缩载荷对早期与成熟成骨细胞Beclin-1水平的影响：早期成骨细胞中循环压缩应变使Beclin-1蛋白表达较静态基线下降，60分钟加载后Beclin-1水平呈下降趋势（对照 vs 60分钟载荷：p = 0.070），180分钟动态压缩较无载荷对照显著抑制Beclin-1表达（对照 vs 180分钟载荷：* p < 0.05）；相反，成熟成骨细胞中60分钟或180分钟加载实验的加载组与无载荷组间Beclin-1表达水平均无显著差异。（7）循环机械应变对Parkin线粒体自噬标志物水平的影响：早期成骨细胞中动态压缩载荷使60分钟与180分钟加载队列各独立实验运行的Parkin表达较静态对照明显下调（n = 3独立生物学重复；对照 vs 60分钟载荷：** p < 0.01；对照 vs 180分钟载荷：p = 0.057）；成熟成骨细胞中重复性压缩同样降低Parkin蛋白蓄积，60分钟加载呈下降趋势但未达统计学显著性，而180分钟连续动态压缩较无载荷对照显著下调Parkin表达（对照 vs 180分钟载荷：** p < 0.01）。

讨论部分总结与结论翻译：阐明骨与软骨适应机械应变的细胞机制是发现骨质疏松与OA等年龄相关肌骨疾病新治疗靶点的基础。已知包埋于矿化骨基质中的骨细胞是驱动机械载荷诱导骨形成的主要机械感受器，骨细胞来源的硬化素是该机械转导级联中的关键分子开关；生理载荷下硬化素产生受抑，释放邻近骨细胞与表面成骨细胞的经典Wnt/β-catenin信号以刺激成骨分化与骨合成，该经硬化素–Wnt/β-catenin轴的细胞间对话被认为是力诱导骨合成代谢应答不可或缺的。与这一经典骨细胞介导的信号范式不同，研究人员既往研究证实机械应激可独立于硬化素–Wnt/β-catenin细胞间通路直接触发成骨细胞分化与骨基质沉积：机械应变激活成骨细胞膜结合葡萄糖转运体1（Glut1）增强葡萄糖摄取，进而调控细胞内能量感受器Sirtuin 1（SIRT1）并解除关键成骨转录因子Runx2的抑制，该Glut1–SIRT1–Runx2代谢轴确立成骨细胞具备内在机械感受能力，可直接重塑细胞能量代谢与成骨活性；由于成骨细胞无论经直接刺激还是骨细胞信号最终均执行骨形成，阐明其自主应激适应能力尤其是内部保护性防御机制具有关键病理生理重要性。研究人员因此研究了与关节软骨细胞一样持续暴露于循环机械载荷的软骨下骨成骨细胞的应激防御能力。软骨下骨重塑对OA骨软骨关节损伤的贡献日益受到临床与基础研究关注，软骨下结构病理性改变被认为是OA发展的标志性特征；由软骨下骨板与下方骨小梁组成的该组织在结构、生物力学与生化上与覆盖其上的关节软骨相连，机械过载在明显软骨降解之前即破坏软骨下骨转换，软骨下骨成骨细胞与骨细胞作为主要机械感受器，在病理应变下促进疾病跨越骨–软骨界面进展，使骨软骨交互对话成为OA发病的关键因素。因此，理解软骨下骨成骨细胞如何保护自身对抗机械应激至关重要；自噬作为选择性降解机制清除受损蛋白与功能障碍细胞器，维持代谢质量控制与细胞稳态。本研究证明重复性机械载荷下调软骨下骨成骨细胞中关键自噬调控因子ATG5、Beclin-1与Parkin的表达：在三维培养系统中，60或180分钟动态压缩载荷较无载荷条件显著抑制这三种调控因子；鉴于ATG5与Beclin-1是自噬体起始与成熟的基础，机械应激诱导的这些因子抑制可能损害受损细胞器清除，导致细胞毒性蛋白聚集体在软骨下骨成骨细胞内蓄积。机制上，ATG5与ATG12形成泛素样复合物驱动自噬体膜延伸，同时通过细胞骨架相互作用参与凋亡信号；Beclin-1与Vps34、Vps15协调形成III类磷脂酰肌醇3-激酶复合物启动自噬囊泡形成；研究结果表明生理水平的重复性压缩应变抑制软骨下骨成骨细胞中ATG5与Beclin-1，损害基础自噬能力并威胁软骨下骨微环境中的细胞存活。除核心自噬机器外，重复性压缩载荷还降低线粒体自噬中枢调控因子Parkin的表达，这与研究人员既往在OA软骨细胞中观察到的机械应激抑制Parkin介导的线粒体自噬一致；Parkin选择性靶向去极化受损线粒体进行自噬清除，在多种组织中维持线粒体质量控制，而线粒体功能障碍与细胞衰老及OA等退行性关节疾病密切相关，因此机械应变下软骨下骨成骨细胞中Parkin耗竭很可能损害线粒体周转，破坏软骨下骨细胞能量稳态。超微结构TEM分析证实了该自噬损害：无载荷对照（早期与成熟成骨细胞）显示丰富的自噬体、溶酶体、自噬体–溶酶体融合事件及成熟自噬溶酶体，反映活跃的基础细胞器周转；相反，重复性压缩载荷使两种成骨细胞成熟阶段的自噬体与自噬溶酶体均显著减少；值得注意的是，接受180分钟连续压缩载荷的早期成骨细胞缺乏清晰的自噬结构，反而显示未降解受损细胞器的广泛蓄积；由于自噬体–溶酶体降解通常将细胞碎片循环为基本氨基酸与代谢物以供结构维持，这些TEM观察表明生理水平的重复性应变抑制软骨下骨成骨细胞的自噬降解机器。为完整描述这些自噬动态，需区分自噬体改变反映自噬诱导加速还是自噬溶酶体清除受阻，测量自噬流对阐明机械应激破坏囊泡运输的精确阶段至关重要；未来研究应结合共聚焦荧光显微镜与自噬体/溶酶体特异性探针及溶酶体酸化抑制剂，而在三维胶原海绵基质中进行活细胞共聚焦成像的技术挑战将是主要技术目标。此外，由于Parkin介导的线粒体自噬涉及多步分子机器，确定线粒体自噬损害的确证需要全面的功能测定，如线粒体膜电位追踪、线粒体–LC3共定位及线粒体自噬报告构建体；然而，通过流式细胞术、微板读取仪或标准荧光显微镜进行这些测量受限于载荷后难以从三维胶原支架中分离存活且形态完整的成骨细胞，开发能在完整三维构建体内直接评估动态细胞器周转的原位分析方法仍是持续优先事项。同样，评估机械应变下线粒体功能状态需要直接评估线粒体膜电位（超极化/去极化）、活性氧（reactive oxygen species, ROS/线粒体ROS）产生及线粒体DNA完整性；由于嵌入三维胶原凝胶的活成骨细胞实时共聚焦成像仍受方法学限制，研究人员使用总细胞蛋白提取物评估间接能量标志物（见补充数据），这些分析显示重复性压缩载荷显著降低软骨下骨成骨细胞中细胞ATP含量与线粒体NAD活性；虽然这些生化测定证实能量损害，研究人员承认需要建立先进成像方法以直接观察应变下动态线粒体流。有趣的是，临床应用常采用生物物理能量如压电与摩擦电刺激增强内在骨再生，骨组织中机械诱导的电位差刺激骨细胞、成骨细胞与祖细胞，促进成骨微环境；与这一合成代谢潜能一致，本研究表明重复性压缩应变提高早期与成熟成骨细胞的ALP产生，表明机械力促进成骨分化与功能活性；此外，180分钟载荷的成熟成骨细胞TEM成像显示密集的细胞内胶原纤维组装，表明活跃的成骨基质合成，这些观察与支持机械刺激用于骨修复的临床证据一致。研究人员的累积发现呈现一个有趣的生理情景：重复性机械压缩刺激成骨细胞功能活性（ALP与基质产生增加），同时抑制自噬与线粒体自噬质量控制（ATG5、Beclin-1与Parkin减少）；研究人员提出两种可能且非互斥的解释来说明成骨分化与自噬清除之间的这种时间与功能差异：阶段依赖性生理重编程，即自噬因子下调可能反映成骨成熟过程中细胞程序的自然转变而非急性病理崩溃，支持该概念的是，有报道MC3T3-E1前成骨细胞中RUNX2过表达可提高ALP、骨钙素与矿化，同时抑制Beclin-1与ATG5表达，尽管该研究未施加机械应变，但表明成骨分化与自噬抑制可在骨基质合成过程中被生物学协同调控；稳态能力耗竭，即延长机械应变可能将成骨细胞推至其适应阈值之外，成骨细胞最初启动合成代谢应答（上调ALP）以适应物理应变，但持续载荷可能压垮自噬循环网络，导致细胞器质量控制进行性下降，随着时间推移，这种未解决的细胞器损伤可能损害长期成骨细胞活力。总之，施加于软骨下骨成骨细胞的重复性机械应变促进成骨激活，同时损害自噬防御机制；尽管机械载荷在骨骼组织中总体发挥合成代谢、骨形成效应，但靠近关节界面的软骨下骨经历强烈、局部的循环载荷；在这些条件下，应变诱导的自噬细胞器清除下降使缺陷线粒体与受损蛋白在软骨下骨成骨细胞中蓄积，这种未解决的细胞应激可能驱动软骨下骨退变，最终促进OA的发生与进展。研究结论翻译：研究数据表明，即使处于生理水平，重复性机械应力所引起的线粒体自噬与细胞自噬减少，也可能导致细胞内缺陷线粒体和异常细胞蛋白的蓄积，从而降低成骨细胞活性并影响软骨下骨组织稳态，最终促进OA进展。