《International Journal of Molecular Sciences》：The Effects of the Medium’s pH Value on the Efficiency of the Enzymatic Transglycosylation Catalyzed by Escherichia coli Purine Nucleoside Phosphorylase and Lactobacillus leichmanii Nucleoside Deoxyribosyltransferase Type II
编辑推荐：
研究人员考察了反应介质pH值对由大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（EcPNP）与莱希曼乳杆菌II型核苷脱氧核糖转移酶（LlNDTII）所催化酶促转糖基化反应的速率与产率的影响。在EcPNP存在下、pH 5.5时，与腺苷（Ado）相比，观察到肌苷（Ino）生成速率显著降
研究人员考察了反应介质pH值对由大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（EcPNP）与莱希曼乳杆菌II型核苷脱氧核糖转移酶（LlNDTII）所催化酶促转糖基化反应的速率与产率的影响。在EcPNP存在下、pH 5.5时，与腺苷（Ado）相比，观察到肌苷（Ino）生成速率显著降低。嘌呤O6位取代基可中和6-氧代基团对反应速率的负面影响。嘌呤N6位取代基对转糖基化速率几乎无影响。在LlNDTII催化的反应中，由4-氧代嘧啶生成核苷的速率在pH 5.5时更高，但产率较pH 7.0时下降约10%；同时还揭示了目标核苷产率对所使用酶浓度的异常依赖性。
研究背景方面，核苷是一类重要的天然化合物，是开发具有广泛生物活性新药的基础，核苷类似物具有抗病毒、抗菌、抗真菌及抗肿瘤等多种生物活性，在对抗耐药微生物方面潜力巨大。基于酶促转糖基化反应生产具有实用价值的修饰核苷的技术正得到广泛开发，生物催化反应具有区域选择性和立体选择性以及可调控性，可补充、增强或部分替代化学合成方法的某些步骤，将各酶促反应组合为多步酶催化级联还带来额外优势且环境友好。酶促转糖基化由两个偶联的磷酸解反应组成，通常由糖基转移酶类（EC 2.4）酶催化，核苷磷酸化酶（NPs，EC 2.4.2.x）和核苷-2′-脱氧核糖转移酶（NDTs，EC 2.4.2.6）主要用作生物催化剂。目前关于pH对酶活性影响的信息很多，但研究人员未能找到旨在确定酶促转糖基化产率（速率、结果、效率）与反应介质pH值及碱基受体结构（即嘌呤环第6位构型6-氧代与6-氨基、嘧啶第4位4-氧代与4-氨基）依赖关系的研究。研究人员认为其研究结果可能对药理学和生物技术产业有用且适用。
研究人员开展了考察pH对在EcPNP和LlNDTII存在下6(4)-氧代或6(4)-氨基嘌呤（嘧啶）衍生物酶促转糖基化过程影响的研究，得出以下结论：在EcPNP催化反应中，pH 5.5时次黄嘌呤O6-氧代基团对酶促转糖基化速率的区分效应在引入取代基后基本消除；庞大亲脂性取代基可能影响EcPNP活性中心的结合并影响反应速率。LlNDTII催化转糖基化结果亦表明反应混合物pH影响反应速率和产物产率：对于N4位带游离氨基的胞嘧啶（Cyt），最大反应速率在pH 7.0时达到，pH 5.5时反应较慢但两者均获定量产率，pH 8.5时胞苷生成速率最低且产率略降；对于第4位含游离羰基的尿嘧啶衍生物，转糖基化速率在pH 5.5时最高、pH 8.5时最低，且反应速率随尿嘧啶第5位取代基性质而变化；此外还发现目标核苷产率依赖LlNDTII浓度。在pH 5.5进行酶促转糖基化可使目标糖基供体几乎100%消耗于目标核苷合成，尽管反应速率下降（次黄嘌呤情况下更显著）。糖基供体7-甲基鸟苷（7-mGuo）浓度下降速率在所有反应中从pH 5.5到8.5递增。若不计供体的消耗和/或非靶向损耗，在pH 5.5进行酶促转糖基化似不可取，尤其在杂环第6位含游离羰基的次黄嘌呤衍生物情况下。该研究的意义在于揭示了pH值与碱基受体结构对转糖基化效率的联合影响规律，为核苷类似物的生物催化合成条件优化提供了依据。
技术方法方面，研究以7-甲基鸟苷（7-mGuo）或7-甲基-2′-脱氧鸟苷（7-mdGuo）为糖基供体，分别以EcPNP（0.3 U）和LlNDTII（0.12 U，部分实验为7.8×10
?3 U、26×10
?3 U、52×10
?3 U）为催化剂，在pH 5.5（50 mM NaOAc）、pH 7.0与8.5（50 mM Tris-HCl）缓冲液中于37 °C（LlNDTII为20 °C）进行转糖基化反应；以HPLC（高效液相色谱）监测反应进程与产率；采用分子 Operating Environment（MOE）软件进行分子结构准备、PM3初步能量最小化与构象搜索，并采用ORCA软件包在密度泛函理论（DFT）框架下以B3LYP泛函、D4色散校正、6-311++G(d,p)基组及CPCM（导体样极化连续介质模型）水环境模型进行量子化学计算，比较N7H与N9H互变异构体能量。嘌呤与嘧啶碱基来自Engelhardt分子生物学研究所核苷保藏中心，酶与胸苷购自Sigma-Aldrich。
研究结果方面，第一，pH对EcPNP催化嘌呤核苷合成的影响：以腺嘌呤（Ade）、次黄嘌呤（Hyp）、6-巯基嘌呤（6-MP）和2,6-二氯嘌呤（2,6-DCP）为受体，pH变化对腺苷合成速率几乎无影响，仅在pH 5.5时略降但3 h内完全转化；而Hyp在pH 5.5时速率显著下降，24 h转化率约85%，pH 7.0与8.5时肌苷合成速率与腺苷几乎相等。第二，O6-、N6-、S6-取代衍生物的影响：O6-苄基次黄嘌呤在pH 5.5时约40 min完全转化，O6-甲基次黄嘌呤20 min转化约68%、1 h约81%，均快于相应N6-甲基腺苷；6-MP及其甲氧基、苄基衍生物在pH 5.5和7.0时S6-苄基衍生物形成速率仅略高于S6-甲基衍生物。第三，互变异构体计算：Ade的N9H形式相对能量低于N7H；Hyp两种形式能量相近；甲基和苄基取代基稳定N9H形式；6-MP是唯一N7H相对能量低于N9H的化合物，可能是其酶促糖基化效率最低的原因之一，提示嘌呤碱基N7H与N9H互变异构体的相对稳定性与其被EcPNP酶促糖基化效率之间存在相关性。第四，2,6-DCP在pH 5.5时20 h产率仅11%，pH 7.0与8.5时2.5 h产率分别为96.7%与71.6%；所有反应中糖基供体7-mGuo浓度下降速率从pH 5.5到8.5递增，与核苷咪唑环非特异性断裂副反应有关。第五，LlNDTII催化嘧啶碱基转糖基化：以胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-乙烯基尿嘧啶、O4-甲基尿嘧啶为受体，Cyt最大速率在pH 7.0，pH 5.5较慢但两者定量产率，pH 8.5最慢且产率略降；尿嘧啶衍生物最高速率在pH 5.5、最低在pH 8.5，最大产率在pH 7.0，pH 5.5产率下降约10%，pH 8.5显著下降。第六，LlNDTII催化嘌呤碱基转糖基化：Hyp在pH 5.5比pH 7.0反应更快，pH 8.5无反应；与O4-mUra不同，Hyp的甲基化羰基不阻碍反应，可归因于Tyr157′末端羧酸与嘌呤N7原子形成氢键，而嘧啶碱基情况下氢键形成于C-末端羧基与O4之间；Ade在不同pH下速率与产率无变化，进一步证明嘌呤受体结构中羰基的存在使转糖基化速率和产率依赖pH。第七，LlNDTII产率对酶浓度的异常依赖：pH 8.5时反应产率异常依赖所用酶浓度；在26×10
?3 U时，Cyt、Ura、Thy、5-BrUra、Hyp和O6-mHyp反应达定量产率，5-VinUra转化率达88%，高于7.8×10
?3 U时pH 5.5和7.0的转化率，后者较低产率可能是逆向水解反应的结果；5-FUra和5-CF3Ura在26×10
?3 U时产率仅31%和25%，酶量加倍至52×10
?3 U时5-FUra达定量产率、5-CF3Ura达86%。研究人员认为pH 8.5时反应速率下降有利于分析反应监测，且较高酶浓度有助于达到最大产率，但制备性转糖基化不宜用pH 8.5缓冲液；pH 5.5也非优选，因许多反应产率降低；推测放大转糖基化反应的最佳pH值为7.0。
讨论部分总结：基于结果可得出结论，在EcPNP催化反应中，pH 5.5时次黄嘌呤O6-氧代基团对酶促转糖基化速率的区分效应在加入取代基后基本消除；庞大亲脂性取代基可能影响EcPNP活性中心结合并影响反应速率，如O6-BnHyp和S6-BnMP-Rib的情况；以6-MP及其衍生物进行的研究显示pH 5.5和7.0时S6-苄基巯基嘌呤核苷形成速率较S6-甲基衍生物增加；当受体碱基为腺嘌呤时，N6位取代基与游离氨基相比对转糖基化速率仅可忽略的影响。LlNDTII催化转糖基化结果亦表明反应混合物pH影响反应速率和产物产率：N4位带游离氨基的Cyt最大反应速率在pH 7.0，pH 5.5较慢但均获定量产率，pH 8.5胞苷形成速率最低且产率略降；第4位含游离羰基的尿嘧啶衍生物转糖基化速率在pH 5.5最高、pH 8.5最低，反应速率随尿嘧啶第5位取代基性质而变化；此外发现目标核苷产率依赖LlNDTII浓度。在pH 5.5进行酶促转糖基化可使目标糖基供体几乎100%消耗于目标核苷合成，尽管反应速率下降（次黄嘌呤情况下更显著）。糖基供体7-mGuo浓度下降速率在所有反应中从pH 5.5到8.5递增。若不计供体的消耗和/或非靶向损耗，在pH 5.5进行酶促转糖基化似不可取，尤其在杂环第6位含游离羰基的次黄嘌呤衍生物情况下。
