《International Journal of Molecular Sciences》：Upregulated SMURF1 and miR-520d-5p in Basal Cell Carcinoma: Possible Implications for TGF-β/SMAD Signalling
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基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是最常见的皮肤癌类型。SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1（SMAD-specific E3 ubiquitin protein ligase 1，SMURF1）是一种参与调控转化生长因子-β（tra
基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是最常见的皮肤癌类型。SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1（SMAD-specific E3 ubiquitin protein ligase 1，SMURF1）是一种参与调控转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）信号通路的蛋白，而miR-520d-5p可能在BCC的发生和发展中发挥作用。在本研究中，研究人员探讨了已知影响癌症发病机制的SMURF1和miR-520d-5p在BCC发病机制中的潜在作用。研究纳入了30例BCC组织和30例非癌性皮肤组织。通过定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）测定基因表达水平。研究人员进行了计算机模拟分析（in silico analyses）以识别可能与BCC相关的基因和信号通路。与对照组相比，SMURF1和miR-520d-5p在BCC组织中的表达显著升高（p = 0.029和p = 0.011）。根据计算机模拟分析，SMURF1和miR-520d-5p被预测参与TGF-β信号通路。miR-520d-5p被预测可调控TGF-β信号通路中的多个靶基因，这需要实验验证。研究结果表明，SMURF1和miR-520d-5p在BCC中表达上调，可能参与BCC的发病机制。这两种分子在BCC组织中均表达上调，并参与TGF-β信号通路的调控。根据计算机模拟分析，SMURF1、SMAD2、SMAD4、TGFBR1、SMAD7、SMURF2、RUNX2、MAPK1和TGFB3是TGF-β信号通路中的关键基因，可能与BCC发病机制相关。
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一、研究背景与目的
基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是最常见的皮肤恶性肿瘤，具有局部侵袭性强但转移率低的特点。关于BCC的起源细胞一直存在争议，尽管BCC在形态上类似表皮基底层细胞，但目前认为其可能起源于毛囊细胞，这一观点得到了BCC中毛囊相关蛋白的表达以及其与Sonic hedgehog基因关联的支持。Patched Hedgehog基因突变与30%–75%的散发性BCC病例相关。Hedgehog与TGF-β信号通路之间存在明显的交叉对话，TGF-β信号通路中的基因兼具肿瘤抑制和促癌活性。
SMURF1是Nedd4家族蛋白之一，在神经、肺、生殖器官和骨骼等多种组织中表达。最初发现SMURF1通过泛素化降解SMAD1来阻断细胞内TGF-β/BMP（骨形态发生蛋白）通路，从而调控骨形成。SMURF1在肿瘤发展中发挥致癌作用，参与调控细胞极性、肿瘤细胞侵袭和化疗耐药。已有研究表明，SMURF1在肿瘤中的表达较匹配的正常癌旁组织显著升高，且其高表达与血管侵犯、较大肿瘤尺寸、远处转移、淋巴结转移、晚期肿瘤-淋巴结-转移（tumour-node-metastasis，TNM）分期以及生存期缩短相关。
miR-520家族在乳腺癌中被报道通过参与调控TGF-β和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路发挥抗肿瘤miRNA（anti-onco-miRNA）的作用。miR-520d-5p在宫颈癌组织和细胞系中表达下调，可抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT信号通路的激活，并在结直肠癌中抑制肿瘤生长和转移。此外，miR-520d-5p被预测靶向SMURF1（miRDB评分83/100），但该相互作用尚未经过实验验证。尽管既往研究报道了SMURF1和miR-520d-5p在不同癌症中的表达变化，但这两个分子在BCC中的作用尚不清楚。本研究旨在通过分子生物学和计算机模拟方法阐明SMURF1和miR-520d-5p对BCC发病机制的潜在影响。
二、主要技术方法
研究人员从Mu?la S?tk? Ko?man大学病理学系档案中获取福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）组织样本，其中BCC组织30例作为患者组，色素痣手术切缘的非病变组织30例作为对照组，所有组织均取自面部区域。BCC组包含16名女性和14名男性，平均年龄72.42±11.24岁；对照组包含12名女性和18名男性，平均年龄69.55±12.66岁。BCC组浸润深度平均为0.27±0.14 mm。两组在性别分布和年龄上无统计学显著差异。
研究采用TRIzol试剂从FFPE组织中提取RNA，使用cDNA合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA，通过实时定量PCR（qPCR）检测SMURF1和miR-520d-5p的表达水平，以GAPDH作为SMURF1的内源性对照，U6作为miR-520d-5p的内源性对照，采用2?ΔΔCT方法评估相对基因表达。生物信息学分析方面，使用STRING v12.0进行SMURF1的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）和功能富集分析，使用DisGeNET v21.0获取BCC（UMLS CUI：C4721806）的基因-疾病关联数据，使用miRSystem和miRDB预测hsa-miR-520d-5p的潜在靶基因，使用DIANA-miRPath v3.0以KEGG通路为参考数据库进行通路富集分析。统计分析在R（版本4.5.1）中进行，包括Shapiro-Wilk正态性检验、Wilcoxon-Mann-Whitney检验、Welch's t检验、Fisher精确检验、Spearman秩相关分析和线性回归模型。
三、研究结果
SMURF1和miR-520d-5p表达水平。 通过qPCR检测发现，与对照组相比，BCC组织中SMURF1和miR-520d-5p的表达水平均显著升高（p = 0.029和p = 0.011）。
相关性分析。 通过Spearman秩相关分析评估靶基因表达与临床/人口统计学参数之间的关系。在BCC组中，SMURF1与miR-520d-5p表达水平之间无统计学显著相关性（ρ = 0.090，p = 0.644）。两种分子的表达水平与患者年龄在BCC组和对照组中均无显著相关性（p > 0.05）。SMURF1和miR-520d-5p的表达与BCC组织的浸润深度均无显著相关性（ρ = 0.075，p = 0.727和ρ = 0.222，p = 0.298）。
SMURF1表达按年龄和性别的亚组及多变量分析。 在BCC组织中，SMURF1表达在≤70岁和>70岁参与者之间无显著差异（p = 0.580），年龄与SMURF1表达无相关性（ρ = ?0.005，p = 0.981）。在对照组中，>70岁参与者的SMURF1水平显著低于≤70岁参与者（中位数2.13 vs. 4.92；p = 0.047），但该年龄相关差异在BCC组织中未观察到，线性模型中的组别×年龄交互作用无统计学显著性（p = 0.675）。SMURF1表达在BCC组织（p = 0.214）、对照组（p = 0.531）和总体队列（p = 0.076）中均未显示性别间的显著差异。在校正年龄和性别的多变量线性回归模型中，BCC组SMURF1表达升高仍具有统计学显著性（p = 0.027），而年龄（p = 0.752）和性别（p = 0.152）均未显示独立的显著关联。
计算机模拟分析。 STRING网络分析揭示了SMURF1与其相互作用蛋白之间的复杂网络，包括TGF-β受体家族成员（TGFBR1、TGFBR2）、小GTP酶RHOA以及SMAD蛋白（SMAD1、SMAD2、SMAD5、SMAD7）。功能富集分析确定了与细胞信号传导相关的生物学过程，特别是跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号传导、生长因子信号传导和内源性刺激应答。Reactome通路分析强调了SMURF1参与TGF-β信号通路，包括“TGF-β家族成员信号传导”和“TGF-β受体信号传导”等特定通路，以及“上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）中的TGF-β信号传导”。分子功能富集分析显示与SMAD结合、TGF-β受体结合和激活素结合显著相关，E3泛素连接酶结合的结果支持SMURF1可能通过泛素介导的蛋白降解调控TGF-β信号传导。
DisGeNET数据库共鉴定出557个与BCC相关的基因。STRING网络中的SMAD2、SMAD7、TGFBR1、TGFBR2和RUNX2基因也包含在DisGeNET列表中。miRSystem预测hsa-miR-520d-5p有782个靶基因，其中STRING网络中的SMAD4、SMURF2和SMURF1基因是miR-520d-5p的靶标，DisGeNET列表中的TGFB3基因也是miR-520d-5p的靶标。miRDB共报告了2404个hsa-miR-520d-5p靶基因，包括SMURF2（靶标评分98/100）、SMAD2（靶标评分89/100）、RUNX2（靶标评分61/100）、SMURF1（靶标评分83/100）、TGFBR1（靶标评分73/100）和SMAD4（靶标评分67/100）。DisGeNET数据库中BCC相关基因MAPK1（靶标评分100/100）、TGFB3（靶标评分85/100）、TGFBI（靶标评分74/100）和TGFB2（靶标评分72/100）也是miR-520d-5p的靶标。
DIANA-miRPath以microT-CDS方法搜索KEGG数据库，鉴定出hsa-miR-520d-5p可能影响基因的28条通路。在与BCC可能相关的显著信号通路中，TGF-β信号通路排名第一。FST、TGFBR1、SMAD2、PPP2CA、SMURF2、SMAD3、INHBA、ID4、ACVR1、ACVR2B、ZFYVE16、SMAD4、SMAD5、BMP2、SP1、ACVR1C、BMPR1A、MAPK1和BMPR2基因是TGF-β信号通路中miR-520d-5p的靶标。其中FST、TGFBR1、SMAD2、SMAD4、BMP2、BMPR1A和MAPK1被DisGeNET鉴定为BCC相关基因。
四、讨论与结论
讨论部分指出，SMURF1在多种癌症中通过泛素化和降解SMAD蛋白发挥致癌作用。SMURF1直接与磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶I型γ（phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase type I gamma，PIPKIγ）相互作用并导致其降解，PIPKIγ在肺癌组织中高表达。在乳腺癌中抑制SMURF1可减少ERα阳性细胞增殖。SMURF1高表达与胶质瘤的侵袭和不良预后相关。在乳腺癌细胞系中敲低SMURF1可抑制MEK1和EGF诱导的侵袭和迁移。SMURF1介导的ARHGAP26泛素化在卵巢癌中促进迁移和侵袭。
尽管miR-520d-5p在宫颈癌、胃癌、结直肠癌和肝癌细胞中表现出肿瘤抑制活性，但研究人员在BCC中发现了更高的miR-520d-5p水平。研究人员强调，这仅是一种关联，本身并不证明致癌活性。miR-520d-5p在BCC中的上调可能反映其环境依赖性作用，但仅凭表达升高不能解释为致癌潜力的证据。值得注意的是，同一前体来源的3p链miR-520d-3p在黑色素瘤组织中下调，并通过靶向ASF1B抑制黑色素瘤细胞增殖，表明该miRNA家族成员在皮肤癌中可具有保护性、肿瘤抑制作用。
计算机模拟分析预测miR-520d-5p靶向大量与TGF-β通路相关的基因，包括SMAD2、SMAD4、SMURF1、SMURF2和TGFBR1。然而，研究人员指出这些预测仅为假设生成性质，靶标预测算法主要依赖序列互补性，会产生许多假阳性靶标。值得注意的是，尽管计算机模拟预测miR-520d-5p可能靶向SMURF1，在典型调控下应预期存在反向关系，但研究人员观察到两种分子在BCC组织中平行升高，且表达无显著相关性。研究人员提出了几种可能解释：miR-520d-5p可能作为对SMURF1升高的补偿性负反馈反应被诱导；miRNA通常通过抑制翻译发挥作用，其效应在蛋白水平可能比mRNA水平更明显，而研究仅检测了SMURF1 mRNA而非蛋白；SMURF1还受其他miRNA和转录机制调控；两种分子可能被共同的上游信号协同上调；FFPE组织包含肿瘤和基质细胞，不同细胞区室的表达可能掩盖两者之间的关系。
关于年龄和性别分析，BCC中SMURF1表达升高与年龄和性别无关。在对照组中，>70岁参与者的SMURF1水平倾向于较低，但这一探索性观察未通过多重检验校正。对于miR-520d-5p，BCC与对照组之间的差异在老年人群中更大，但该交互作用在校正后不显著，且对照组为痣缘组织而非年龄匹配的健康皮肤，因此该发现仅为假设生成性质。
研究结论指出，SMURF1和miR-520d-5p在BCC组织中的表达显著高于非癌性对照组，且这种升高与年龄和性别无关。尽管SMURF1是miR-520d-5p的预测靶标，但两者的表达并未呈反向相关，且该相互作用未经实验验证，平行升高现象仍需功能验证。计算机模拟分析预测两种分子均与TGF-β信号通路相关。研究结果仅表明SMURF1和miR-520d-5p与BCC存在关联，并未确立因果或治疗作用。在将这些分子视为潜在的生物标志物或治疗靶点之前，需要进行蛋白水平分析、报告基因实验和BCC模型中的功能研究。
