声带病变中IL6、CXCL9、LIF与LIFR转录本丰度：与组织学及窄带成像血管模式的关系

《Cancers》：Transcript Abundance of IL6, CXCL9, LIF and LIFR in Glottic Lesions: Relationship to Histology and to Narrow-Band Imaging Vascular Patterns

　　

背景：窄带成像（narrow-band imaging, NBI）是喉部病变评估中的成熟辅助技术，但高风险血管模式背后的分子过程尚不明确。研究人员比较了IL6、CXCL9、LIF和LIFR在声门癌与非癌性病变之间的转录本丰度，将其与NBI模式相关联，并检验了IL6是否能为NBI增加诊断信息。方法：在这项前瞻性单中心探索性研究中，62例因声门病变接受手术的患者（33例鳞状细胞癌，29例非癌性病变）接受了术前NBI（采用欧洲喉科学会分类法和Ni分类法）；转录本通过RT-qPCR定量。结果：IL6在癌组织中更高（中位数5.97对比0.30；p = 0.004），将未检出值设为检测限后仍显著（p = 0.001），且在仅限曾吸烟者中亦如此（p = 0.0008）。性别校正减弱了该关联（每10倍增加的OR为1.78，95% CI 0.98–3.23；p = 0.06）；由于所有癌病例均发生于曾吸烟者，无法对吸烟进行校正。CXCL9、LIF和LIFR无差异。将IL6加入NBI未能改善鉴别能力（ΔAUC 0.00–0.02；bootstrap 95% CI包含零）。在非癌性病变内部，IL6在高风险NBI模式中名义上更高（n = 5–7），但分层比较经错误发现率校正后均不显著。结论：IL6转录本丰度在声门癌中更高，但该差异对性别校正敏感，并且在全组织中进行测量时可能反映病变组成成分（包括炎性浸润）。IL6未显示出超越NBI的诊断价值，其与血管形态学的联系仍是一个假说。

研究背景与目的

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC）是喉部最常见的恶性肿瘤，其预后高度依赖诊断时的分期。据GLOBOCAN 2022估计，全球每年约有189,000例新发病例和103,000例死亡。从慢性黏膜炎症经异型增生进展至浸润性癌的过程中，伴随上皮下血管系统的逐步重塑。窄带成像（narrow-band imaging, NBI）利用血红蛋白对约415 nm和540 nm光的差异性吸收来增强黏膜血管对比度，已成为喉部病变评估中白光喉镜的重要辅助手段。常用的两种描述系统为欧洲喉科学会（European Laryngological Society, ELS）分类法（区分纵向与垂直血管改变）和Ni分类法（将逐渐不规则的血管模式与异型增生或恶性转化相关联）。

尽管NBI在喉部肿瘤诊断中的性能已有充分描述，但与可见血管表型相关的生物学过程仍未完全阐明。IL-6信号通路涉及肿瘤细胞存活、免疫调节和血管生成；LIF和LIFR也通过gp130发出信号，其作用具有情境依赖性；CXCL9是一种IFN-γ诱导的CXCR3配体，参与细胞毒性淋巴细胞募集，但其预后和功能效应因肿瘤类型而异。本研究的创新之处在于：同时定量临床遇到的声门病变中IL6、CXCL9、LIF和LIFR的转录本；将转录本丰度与ELS和Ni两种分类系统的血管形态相关联；评估IL6能否在NBI基础上提供增量诊断信息；提供RNA层面的视角，与研究团队自身先前在同一细胞因子组合的免疫组化研究形成互补。主要目的是比较癌与非癌性病变间的转录本丰度；次要探索性目的是评估与NBI模式、吸烟暴露和基因间共表达的关联，并量化IL6的增量诊断贡献。

研究方法概述

这是一项前瞻性单中心观察性研究，于波兰罗兹医科大学耳鼻咽喉头颈肿瘤科进行，连续纳入2020年11月至2023年6月期间符合声带病变手术条件的患者。最终入组62例患者，其中33例鳞状细胞癌（SCC），29例非癌性病变。术前使用具备NBI功能的电子内镜进行经鼻柔性视频内镜检查，由三名对病理结果设盲的观察者通过共识对血管形态进行ELS和Ni分类评分。术中取病变中央非坏死、非出血部位的组织标本（约3–5 mm3），立即置于RNAlater稳定液中保存。使用Maxwell RSC simplyRNA组织试剂盒提取总RNA，采用GoTaq 2-Step RT-qPCR系统进行逆转录，使用TaqMan Fast Advanced预混液和预设计的TaqMan基因表达检测试剂盒在Bio-Rad CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统上进行定量PCR，以GAPDH作为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。统计分析使用GraphPad Prism 10、Statistica 13.1及Python（版本3.14）完成。

研究结果

3.1 队列特征

62例患者的病灶均位于或起源于声门，中位年龄68岁（IQR 59–73），男性42例，女性20例。最终病理诊断为SCC 33例，非癌性病变29例。NBI类别与组织学诊断强烈相关：ELS垂直血管在癌中占主导（32/33），而纵向血管在非癌性病变中占主导（20/29）；Ni 4–5型在癌中占主导（28/33），Ni 1–3型在非癌性病变中占主导（23/29）。

3.2 IL6转录本丰度在癌性与非癌性病变间存在差异

在主要比较中，IL6在癌组织中的表达高于非癌性组织（中位数5.97对比0.30；Mann–Whitney p = 0.004；秩双列相关系数 = 0.45）。CXCL9（p = 0.71）、LIF（p = 0.64）和LIFR（p = 0.15）无显著差异。IL6结果仍低于四个基因的Bonferroni校正阈值（α = 0.0125）。逻辑回归显示，每10倍IL6增加与更高的粗OR相关（OR 2.06，95% CI 1.22–3.48；p = 0.007）；经性别校正后，估计值被削弱（OR 1.78，95% CI 0.98–3.23；p = 0.06）。将比较限制于曾吸烟者时，分离程度更大（中位数5.97对比0.23；p = 0.0008）。将未检出值设为检测限后重复主要比较，IL6差异增强（p = 0.001，秩双列相关系数0.48）。

3.3 按组织学分组分层的NBI分析

在癌组内部，ELS类别几乎不变（仅一例纵向），无法进行有意义的ELS比较；Ni比较效力不足且不显著。在非癌性病变组中，IL6在ELS垂直病变（n = 7）和Ni 4–5病变（n = 5）中更高，CXCL9在ELS垂直病变中更高。然而，在20个可估的分层检验中，无一在Benjamini–Hochberg校正后保持显著（最小q值为0.27）。在非癌性病变中，血管模式和异型增生可能重合，但IL6丰度并未因异型增生状态而不同（中位数0.43对比0.30；p = 0.80），且血管对比的方向在两个异型增生亚层内均得到保留。

3.4 NBI与IL6的诊断效能

以癌为阳性类别，NBI在两个Ni阈值下均具有良好的鉴别能力。在四种分类器均可评估的子集中（n = 57；32例癌，25例非癌性），ELS分类灵敏度最高（96.9%），Ni 5对比1–4阈值特异度最高（92.0%）。IL6单独区分癌与非癌性组织的AUC为0.725（95% CI 0.57–0.86）；在Youden最优截断值（≥0.52）处，表观灵敏度和特异度分别为93.8%和56.0%。将IL6加入NBI未显著改善诊断鉴别能力：所有AUC变化值的bootstrap置信区间均包含零，似然比检验p值介于0.36至0.63之间。使用有序Ni评分时，NBI单独及NBI加IL6的AUC均为0.90，而IL6单独为0.72。

3.5 按组织学分组分层的吸烟暴露分析

癌症患者的累积吸烟暴露量高于非癌症患者（中位数30对比20包年；p = 0.010），且所有癌病例均发生在现在或曾经吸烟者中，而所有七名终生不吸烟者均在非癌组。未检测到组内包年数与IL6之间的显著相关性（癌ρ = 0.29，p = 0.11；非癌ρ = 0.04，p = 0.84）。六名可评估的不吸烟者（均在非癌组）的IL6丰度高但变异大（中位数38.41）。非癌组中LIF与包年数之间的负相关（ρ = ?0.56；p = 0.003）来自二次多重检验，应视为探索性。

3.6 LIF与LIFR显示出最强的组内共表达

分别计算癌组和非癌组中的Spearman相关性。LIF和LIFR在两组中均显示出最强的相关性（ρ = 0.73和0.86；两者p < 0.001）。两个相关系数在组间无显著差异（Fisher r-to-z：z = ?1.25，p = 0.21）。其他名义上显著的关联一致性较低且未经多重检验校正。研究人员指出，共享归一化至单一内参基因可能在归一化靶标之间引入正相关。

讨论与结论

本研究测量了手术处理的声门病变中四个细胞因子通路基因的转录本丰度，并将其与两种NBI血管分类系统相关联。IL6在癌组织中的转录本丰度更高，这与既往将IL-6信号传导与头颈部鳞状细胞癌和喉癌相关联的证据一致。然而，将IL6加入NBI并未改善鉴别能力，且其与血管形态学在组织学亚层内的关联并不稳健。IL6的差异对性别校正敏感，且在全组织测量时可能反映病变组成成分（包括炎性浸润）。CXCL9、LIF和LIFR在组间无显著差异，这不应被解读为这些通路不重要——对照组包含异型增生性和炎性病变而非正常黏膜，且全组织测量混合了上皮、免疫和基质信号。LIF和LIFR的强共表达与协调的通路活性一致，但也可能因共同归一化至GAPDH而被夸大。

研究存在若干重要局限性：组织学组间在性别和吸烟状态上存在显著不平衡；基因表达使用单一内参基因（GAPDH）通过全组织RT-qPCR评估；未进行蛋白水平和空间验证；队列为单中心手术选择队列，癌患病率为53%；NBI通过共识评分，其诊断效能应被视为相对于常规单观察者实践的上限；随访数据未系统收集。结论如下：在62例因声门病变手术的患者中，IL6转录本丰度在鳞状细胞癌中高于非癌性病变（中位数5.97对比0.30；p = 0.004；秩双列相关系数0.45），该差异在将未检出值设为检测限后增强（p = 0.001），且在仅限曾吸烟者的比较中持续存在（p = 0.0008）。该关联对性别校正不稳健（每10倍增加的OR为1.78，95% CI 0.98–3.23，p = 0.06），且由于所有癌病例均发生在曾吸烟者中（准完全分离），无法对吸烟进行校正。CXCL9、LIF和LIFR在组间无差异，尽管归一化至GAPDH使这些比较偏向保守。IL6单独区分癌的AUC为0.725，而NBI分类器的AUC为0.84至0.90；将IL6加入NBI使AUC变化0.00至0.02，bootstrap置信区间包含零；因此该队列未提供IL6超越NBI的增量诊断价值的证据，但同时不足以排除高达约0.10 AUC的贡献。由于测量是在全组织中进行的，该差异可能反映病变的细胞组成（包括其炎性浸润），而非肿瘤细胞内在程序。LIF和LIFR在两组中均强共表达（ρ = 0.73和0.86；Fisher r-to-z p = 0.21）。IL6与高风险血管形态学之间的关系基于五至七个病变，未能在多重检验校正后保持显著；该关系作为假说提出，需在有足够效力的空间或单细胞分辨率研究中加以检验。