《Microorganisms》：Dietary Tryptophan Supplementation Causes Distinct Hepatic Transcriptional and Fecal Microbial Responses in Dairy Calves
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日粮色氨酸（Trp）可能影响宿主与微生物的早期发育，但不同添加水平对奶牛犊牛的影响尚不清楚。本研究考察了色氨酸添加对器官发育、血液学参数、肝脏基因表达以及粪便微生物和色氨酸代谢谱的影响。选取36头奶牛犊牛，采用随机完全区组设计分为4个处理组，分别按0、0.25
日粮色氨酸（Trp）可能影响宿主与微生物的早期发育，但不同添加水平对奶牛犊牛的影响尚不清楚。本研究考察了色氨酸添加对器官发育、血液学参数、肝脏基因表达以及粪便微生物和色氨酸代谢谱的影响。选取36头奶牛犊牛，采用随机完全区组设计分为4个处理组，分别按0、0.25、0.50或0.75 g色氨酸/（犊牛·d）添加，每组9头。对所有犊牛进行粪便宏基因组测序和靶向色氨酸代谢物谱分析，并对每处理组6头犊牛进行器官测量和肝脏转录组分析。未检测到处理对器官重量、肠道长度或血液学参数的显著总体效应。粪便犬尿喹啉酸（KYNA）表现出总体处理效应（p = 0.026），且随添加水平呈负线性对比（p = 0.005），0.50和0.75 g/（犊牛·d）组浓度低于对照组。与对照组相比，0.25、0.50和0.75 g/（犊牛·d）组分别有197个上调、170个下调，447个上调、315个下调，以及1691个上调、267个下调的肝脏基因。上调基因富集于嗅觉转导通路，而下调基因在所有添加水平均富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，在两个较高水平还富集于IL-17信号通路。粪便微生物α多样性在各处理间无差异，而群落组成表现出总体处理效应（p = 0.046）。在两个较低添加水平检测到的差异丰度微生物分类群和功能通路多于最高水平。上述发现描述了奶牛犊牛对色氨酸添加的差异性肝脏转录和粪便微生物响应，但尚未建立二者之间的因果关系。
研究背景：新生犊牛早期生命阶段是营养代谢、免疫功能与肠道微生物生态系统逐步建立的关键时期，此阶段由乳源营养向乳与固体饲料并行的营养模式过渡，消化吸收、能量利用、器官发育与免疫稳态均发生快速变化。色氨酸（Trp）作为幼龄动物生长发育必需的功能性氨基酸，除参与蛋白质合成外，还可代谢为多种生物活性化合物，与肠道屏障功能、免疫稳态、氧化应激和能量代谢密切相关。以往犊牛研究多评估色氨酸添加对生长性能、断奶相关行为与应激标志物以及血液学和免疫指标的影响，但其在宿主代谢调控与肠道微生物功能重塑方面的作用尚不充分。肝脏是营养代谢的核心器官，早期营养干预可改变犊牛肝脏中与代谢和免疫过程相关的基因表达；肠道微生物则是早期营养供给与宿主生理功能之间的重要纽带。然而，相对低水平的色氨酸添加能否改变奶牛犊牛肝脏转录谱及粪便微生物组成与功能潜力尚不清楚。研究人员据此假设：色氨酸供给的小幅增加会改变肝脏代谢与免疫相关基因表达及粪便微生物谱，且不同添加水平间响应存在差异。为此，研究人员设置0、0.25、0.50和0.75 g/（犊牛·d）四个添加水平，综合运用肝脏转录组学、粪便宏基因组学和粪便色氨酸相关代谢物靶向谱分析开展研究。
主要关键技术方法：研究选用36头6–7日龄、出生体重相近（41.45 ± 5.30 kg）的奶牛犊牛，采用随机完全区组设计分为4组，每组9头，雌雄分布均衡，经7 d适应期后开展为期63 d的正式饲养试验，各处理组以相同基础日粮为基础，每日一次经口灌服色氨酸或生理盐水。试验结束时采集全部犊牛直肠新鲜粪便，用于宏基因组测序（DNBSEQ-T7平台，150 bp双端 reads）和基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC–MS/MS）的靶向色氨酸代谢物分析；每处理组随机选取6头犊牛屠宰，称量器官重量、测量肠道长度并采集肝脏组织进行转录组测序（比对 Bos taurus 参考基因组 ARS-UCD2.0）。差异表达分析采用 edgeR，微生物差异丰度分析采用 MaAsLin2，各指标采用线性混合效应模型分析并评估线性、二次和三次对比。
研究结果：
3.1 器官重量、肠道长度与血液学参数：日粮处理对器官重量和肠道长度无显著总体影响；胸腺重量呈显著二次对比（p = 0.021），但总体处理效应不显著（p = 0.099）。日粮色氨酸添加对任何血液学参数均无显著总体影响，但白细胞、淋巴细胞和单核细胞总数随添加水平呈正线性响应（p < 0.05）。
3.2 粪便色氨酸代谢物：靶向分析定量了32种色氨酸相关代谢物。粪便犬尿喹啉酸（KYNA）呈显著总体处理效应（p = 0.026）和负线性对比（p = 0.005），TRP2和TRP3组低于CON组，TRP1组居中；N-乙酰-5-羟色胺呈二次响应（p = 0.031），但总体处理效应不显著（p = 0.200）；未检测到显著三次响应。
3.3 肝脏转录组响应：24个肝脏样本测序共获得1,001,417,690条高质量双端 reads，平均每样本41,725,737条。与CON相比，TRP1含367个差异表达基因（DEGs，197上调、170下调），TRP2含762个（447上调、315下调），TRP3含1958个（1691上调、267下调）。KEGG色氨酸代谢通路上，TRP1中AOX4上调；TRP2中AOX4和IDO2上调；TRP3中IDO2、EHHADH、ALDH1B1、DLST和CYP1B1均上调。上调基因在三个比较中均富集于嗅觉转导通路（贡献基因包括OR11H7，TRP2和TRP3还包括OR5P5），TRP1和TRP2中富集于中性粒细胞胞外诱捕网形成（包括组蛋白基因H2BC8和H2BC12），TRP2和TRP3中富集于类固醇激素生物合成（HSD3B1、CYP21A2、UGT2B10），TRP2还富集于视黄醇代谢（CYP3A74、UGT2B10）。下调基因在三个比较中均富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用和病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用（IL6、CXCL2、CSF3参与），TRP2和TRP3中富集于IL-17信号通路（CCL20、CXCL8、S100A8、S100A9共享下调，TRP2中IL17A下调）；其他富集通路包括TRP1的胰腺分泌（CELA2A、PLA2G2D1）和α-亚麻酸代谢（PLA2G2D1）、TRP2的肠道IgA产生免疫网络（IL6、PIGR）、TRP3的原发性免疫缺陷（CD40LG）。
3.4 粪便微生物多样性、分类组成与功能谱：色氨酸添加不影响粪便微生物丰富度、Shannon多样性和Simpson多样性；基于Bray–Curtis的主坐标分析显示组间大幅重叠，前两轴分别解释15.69%和9.64%的变异，但PERMANOVA检测到群落组成的处理相关差异（R2 = 0.105，p = 0.046），多元离散度无显著差异（PERMDISP，p = 0.544）。MaAsLin2分析显示，在检测的395个属中，TRP1与CON、TRP2与CON、TRP3与CON比较分别有55、55和15个属丰度存在差异：TRP1中20个属升高、35个属降低，TRP2中10个升高、45个降低，TRP3中3个升高、12个降低。Bacteroides_H在三个添加组中丰度均高于CON，Alloprevotella仅在TRP1和TRP2中升高，Alistipes相对TRP2呈正关联（p = 0.023），Avimuribaculum和JAKVKZ01在TRP1和TRP3中升高；丰度降低的属包括TRP1的Bilifractor和JALENY01、TRP2的UMGS1820和JALENY01、TRP3的Muribaculum、Traorella和Oxalobacter。种水平上，TRP1、TRP2、TRP3分别鉴定出203、179和77个差异丰度种，其中TRP1有70个升高、133个降低，TRP2有38个升高、141个降低，TRP3有21个升高、56个降低。KEGG通路方面，187条通路中TRP1、TRP2、TRP3分别有16、14和2条差异丰度通路：TRP1中12条升高（包括核黄素代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、硫代谢、原核生物碳固定通路），4条降低（包括初级和次级胆汁酸生物合成、甘油脂代谢）；TRP2中酮体合成与降解、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢升高，12条降低（包括花生四烯酸代谢、胆固醇代谢、类胡萝卜素生物合成）；TRP3中牛磺酸和亚牛磺酸代谢及原核生物碳固定通路升高。
讨论部分总结：本研究主要发现是肝脏转录和粪便微生物对色氨酸添加水平的响应存在差异——较高剂量比较中检测到更多肝脏DEGs，而两个较低添加水平下与对照差异的微生物分类群和通路更多，这些分子差异未伴随器官和血液学指标的显著总体处理效应。肝脏RNA-seq反映宿主转录调控，粪便宏基因组描述微生物群落组成与功能潜力，二者响应模式不必一致。器官重量无响应可能与当前饲喂条件下额外色氨酸供给未限制结构生长有关，色氨酸缺乏与补充的响应并非对称，且总日粮摄入量未量化，基础色氨酸供给是否限制本试验犊牛的发育仍不确定。血液学响应与既往犊牛研究的差异可能与添加量和持续时间不同有关，白细胞计数无总体响应还可能与免疫细胞丰度与细胞调控之间的区别有关。IDO2在TRP2和TRP3中上调提示色氨酸添加可能影响与犬尿氨酸通路相关的肝脏转录调控，DLST和CYP1B1上调提示肝脏对色氨酸及其衍生物的代谢加工，但未确立相应代谢通量的变化。下调基因中CXCL2、CXCL8和CSF3的下调提示免疫相关转录响应涉及中性粒细胞募集与维持介质，S100A8和S100A9的协同下调提示肝脏响应可能涉及局部免疫细胞募集和炎症放大的调控，但IL-17信号通路富集于下调基因并不代表通路活性降低、肝脏炎症减轻或免疫功能改善。嗅觉转导受体基因（OR11H7、OR5P5）上调的具体功能尚不清楚，其上调不代表代谢功能增强。粪便KYNA浓度降低提示色氨酸添加改变了犬尿氨酸通路代谢物的肠道处置，但粪便测定无法区分肠道产生减少与清除或浓度变化。KYNA的负线性响应提示前体供给增加并未转化为粪便KYNA积累增加，而可能改变肠道KYNA产生、进一步代谢与吸收之间的平衡；NAS的二次响应可能反映其形成与后续转化之间平衡的剂量相关变化。Bacteroides_H在所有添加水平升高而Alloprevotella仅在TRP1和TRP2升高，提示两属对添加水平的响应不同，既往研究将二者与犊牛腹泻恢复、微生物发酵和免疫稳态相联系。Alistipes在TRP2中的丰度模式可能与生长相关微生物变异和营养代谢有关。D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路富集可能反映微生物细胞壁生物合成能力的差异。研究局限包括：未记录生长性能和采食量；粪便仅在试验终点采集，无法评估基线和时序变化；未用RT-qPCR验证选定DEGs；肝脏转录组与粪便宏基因组分别分析，未进行跨组学关联分析，宿主-微生物因果关系及最佳色氨酸添加水平尚未确立。
研究结论（译）：日粮色氨酸添加改变了奶牛犊牛的肝脏基因表达和粪便微生物谱，但对器官重量、肠道长度或血液学参数无显著总体效应。平行谱分析揭示了不同添加水平下肝脏与微生物响应模式的差异。总体而言，上述发现通过表征早期色氨酸添加引起的肝脏转录和粪便微生物响应，拓展了以往聚焦犊牛生长和血液指标的研究，但这些响应之间的功能联系仍有待确立。
