罗伯茨绿僵菌（*Metarhizium robertsii*）侵染抑制草地贪夜蛾（*Spodoptera frugiperda*）细胞免疫并激活体液抗菌反应

《Microorganisms》：Infection with the Entomopathogenic Fungus Metarhizium robertsii Suppresses Cellular Immunity and Activates Humoral Antibacterial Responses in Spodoptera frugiperda

　　

草地贪夜蛾（*Spodoptera frugiperda*）是一种全球分布的农业害虫。罗伯茨绿僵菌（*Metarhizium robertsii*）是一种昆虫病原真菌（entomopathogenic fungus, EPF），在草地贪夜蛾生物防治中具有较大应用潜力。然而，迄今尚无关于罗伯茨绿僵菌与草地贪夜蛾免疫系统相互作用的报道。本研究探究了罗伯茨绿僵菌对草地贪夜蛾的致病性，并证明该真菌对该害虫具有高毒力。罗伯茨绿僵菌侵染可诱导草地贪夜蛾血细胞（hemocytes）发生凋亡（apoptosis）与坏死（necrosis），进而降低循环血细胞丰度。真菌侵染还损害了浆细胞（plasmatocytes）的铺展能力。这些对血细胞的不利影响共同导致宿主细胞免疫反应（包括吞噬作用（phagocytosis）、结节形成（nodulation）和包囊作用（encapsulation））受到显著抑制。同时，罗伯茨绿僵菌侵染上调血细胞中酚氧化酶原（prophenoloxidase, PPO）基因的表达，导致宿主血淋巴（hemolymph）中酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活性显著升高。真菌侵染后，脂肪体（fat body）中抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）基因的转录亦增加。这些体液抗菌反应相关基因的上调增强了血淋巴的抗菌活性。本研究揭示了罗伯茨绿僵菌与草地贪夜蛾之间免疫相互作用的机制基础，加深了对昆虫病原真菌致病机制的理解。

**研究背景**　草地贪夜蛾（*Spodoptera frugiperda*）是起源于美洲热带和亚热带地区的重要农业害虫，已对全球多国玉米产量造成严重损失，2018年首次入侵中国后已扩散至20余省。化学农药长期是其主要防治手段，但广泛施用破坏生态平衡并威胁人类健康，亟需可持续的替代防治策略。昆虫病原真菌（entomopathogenic fungus, EPF）因环境安全、对人无毒而成为有前景的生物防治资源。罗伯茨绿僵菌（*Metarhizium robertsii*）宿主谱广、对多种害虫毒力高，在草地贪夜蛾生物防治中潜力突出。昆虫缺乏适应性免疫，完全依赖先天免疫系统，功能上分为以血细胞（hemocytes）介导的吞噬作用（phagocytosis）、结节形成（nodulation）和包囊作用（encapsulation）为主的细胞免疫分支，以及以抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）合成和酚氧化酶原（prophenoloxidase, PPO）级联激活为特征的体液免疫分支。EPF侵染始于分生孢子附着昆虫表皮，经萌发和附着胞形成穿透体壁，进入血腔后发生二型性转换并分泌细胞毒性毒素；长期协同进化使EPF具备多种逃避和抑制昆虫免疫的毒力策略，如修饰或掩蔽菌体表面碳水化合物表位以逃避识别，以及分泌 destruxin、oosporein 等代谢物进行免疫抑制。然而，此前尚无罗伯茨绿僵菌与草地贪夜蛾免疫系统相互作用的报道，阐明EPF与昆虫宿主的互作机制对开发高效真菌防治策略、提高真菌致病力不可或缺，本研究据此展开。

**研究开展与结论**　研究人员通过浸渍法和血腔内注射法探究了罗伯茨绿僵菌对草地贪夜蛾幼虫的致病性，并系统评价了该真菌对宿主细胞免疫与体液免疫的影响。结果表明，罗伯茨绿僵菌对草地贪夜蛾具有高毒力，幼虫死亡率随孢子浓度和时间呈剂量、时间依赖性升高；真菌侵染诱导血细胞凋亡与坏死、降低循环血细胞数量、损害浆细胞铺展能力，从而显著抑制结节形成、吞噬作用和包囊作用等细胞免疫反应；与此同时，真菌侵染上调血细胞中 PPO 基因表达、提高血淋巴 PO 活性，并上调脂肪体中 AMP 基因转录，增强血淋巴抗菌活性。该研究揭示了罗伯茨绿僵菌与草地贪夜蛾免疫互作的机制基础，加深了对EPF致病机制的理解，为开发提高真菌致病力、加速侵染进程的策略提供了 valuable 线索，并为优化罗伯茨绿僵菌作为草地贪夜蛾高效生物防治剂的实践应用奠定了理论基础。

**关键技术方法**　研究使用罗伯茨绿僵菌菌株 ARSEF 2575（由安徽农业大学惠赠），草地贪夜蛾幼虫于实验室饲养；分别以浸渍法处理三龄幼虫、血腔内注射法处理六龄幼虫进行侵染与生存分析，并选取每头注射 1 × 10⁴ 个分生孢子的剂量开展后续免疫功能实验；通过体内结节形成、体内包囊作用、体外吞噬作用和浆细胞长度测定评估细胞免疫；采用血细胞计数、YO-PRO-1/碘化丙啶（PI）双染检测血细胞凋亡与坏死；测定血浆 PO 活性及对大肠杆菌（*Escherichia coli*）和金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）的抗菌活性；并以逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测免疫相关基因转录，以 Rpl32 为内参基因。

**研究结果**　3.1 罗伯茨绿僵菌侵染降低草地贪夜蛾存活率：通过浸渍和注射两种方式侵染后，幼虫存活率均显著低于对照，死亡率随孢子浓度升高呈剂量依赖性增加，浸渍 1 × 10⁹ 个孢子 mL^?1 八天内累积死亡率达68%，注射 1 × 10⁵ 和 1 × 10⁴ 个孢子分别在84 h和108 h达100%死亡率，据此选定注射剂量用于后续实验。3.2 罗伯茨绿僵菌侵染损害细胞免疫：经大肠杆菌诱导的结节形成在侵染后12、24、48 h均显著减少，体外吞噬能力在24和48 h受抑制，包囊指数在所有检测时间点均显著降低，浆细胞长度在48 h显著缩短，表明真菌侵染严重损害宿主细胞免疫功能。3.3 罗伯茨绿僵菌侵染减少血细胞数量：真菌侵染显著降低血淋巴总血细胞数，粒细胞在12和48 h明显下降，浆细胞在所有时间点显著减少；YO-PRO-1/PI双染显示凋亡率在12、24、48 h均显著升高、坏死率在48 h显著升高，血细胞中 Caspase-2 在所有时间点上调、Cathepsin-like 在24和48 h上调、Caspase-1 和 p53 在12和24 h下调而48 h上调，证实真菌通过诱导凋亡与坏死导致循环血细胞减少。3.4 罗伯茨绿僵菌侵染增强体液抗菌反应：感染幼虫血浆 PO 活性在24和48 h显著升高，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性在24和48 h显著增强。3.5 罗伯茨绿僵菌侵染增强免疫相关基因表达：PPO1 和 PPO2 在所有检测时间点显著上调，四个 AMP 基因（Gallerimycin、Attacin、Lebocin、Gloverin）在12 h无变化或轻度降低、在24和48 h强烈上调，提示血淋巴抗菌活性增强既源于 PO 活性升高也源于 AMP 丰度增加。

**讨论与结论**　讨论部分指出，注射接种较浸渍接种致死更快，归因于直接进入血腔 bypass 了体壁穿透屏障，且选用六龄幼虫是因四、五龄幼虫血淋巴量不足以开展免疫测定；罗伯茨绿僵菌损害结节形成、包囊作用和吞噬作用，浆细胞铺展能力下降可能构成包囊和结节受损的基础，而结果与 Liu 等（2019）关于罗伯茨绿僵菌不影响斜纹夜蛾（*S. litura*）细胞免疫的报道不同，提示宿主种类、真菌菌株或取样时间点可导致不同结局；真菌通过诱导血细胞凋亡和坏死减少血细胞数量，并以减少血细胞数量和损害铺展能力的联合策略抑制细胞免疫，铺展受损机制是否涉及细胞骨架破坏尚待研究；与细胞免疫受抑相反，真菌侵染增强体液抗菌反应，AMP 基因上调与其他真菌感染系统的报道一致，其机制可能与清除逃逸入血淋巴的肠道细菌以减少细菌与真菌竞争营养有关，尚待验证；PPO 基因上调提示真菌可能通过上调宿主 PPO 转录增强血淋巴 PO 活性，真菌对宿主 PPO 激活反应的影响因真菌和宿主种类而异；研究采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌评价免疫应答，而昆虫肠道共生菌可调节真菌毒力甚至易位入血腔，宿主对肠道来源细菌是否产生相同免疫反应尚待进一步研究。结论部分译为：本研究采用幼虫浸渍于分生孢子悬浮液和直接将分生孢子注射入幼虫血腔两种接种方法，探究了罗伯茨绿僵菌对草地贪夜蛾的致病性，并进一步全面评价了罗伯茨绿僵菌侵染对草地贪夜蛾细胞免疫和体液免疫的调节作用。机制分析揭示真菌侵染后宿主体液抗菌反应发生显著改变，关键抗菌肽基因和 PPO 基因转录显著上调。总体而言，这些发现加深了对罗伯茨绿僵菌与昆虫宿主分子互作的理解，阐明了真菌侵染的核心致病机制，为开发提高真菌致病力、加速侵染进程的高效策略提供了 valuable 线索，并为优化罗伯茨绿僵菌作为草地贪夜蛾可持续治理中有前景的生物防治剂的应用奠定了理论基础。