《Plants》：ADS-YOLO: A Multiscale Feature-Enhanced Network for Pepper Seedling Emergence Detection in Complex Plug-Tray Nursery Scenes
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由Xanthomonas citri subsp. citri（Xcc）引起的柑橘溃疡病通常采用铜基制剂进行防治，然而单个产品在实验室与植株试验中的表现可能存在差异。研究人员在平板扩散试验和灌根试验中比较了16种含铜商业制剂，抑菌圈在不同产品间存在差异。然而，
由Xanthomonas citri subsp. citri（Xcc）引起的柑橘溃疡病通常采用铜基制剂进行防治，然而单个产品在实验室与植株试验中的表现可能存在差异。研究人员在平板扩散试验和灌根试验中比较了16种含铜商业制剂，抑菌圈在不同产品间存在差异。然而，硫森铜（Thiosen Copper）在琼脂平板上未产生可见抑菌圈，但在灌根施用后抑制了Xcc生长。在甜橙中，相同标称总铜浓度下，这种抑制作用较波尔多液（Bordeaux Mixture）出现得更早。硫森铜提高了叶片叶绿素指数，而叶片总铜未显著增加，而波尔多液则导致更高的叶片铜积累。在 separately 以枳（Poncirus trifoliata）进行的实验中，两种制剂产生了不同的生长与组织铜响应，且根部处理改变了PtCOPT转录本水平。CsCOPT4在甜橙叶片中的瞬时过表达伴随较低的Xcc种群数量。这些结果揭示了制剂特异性响应，并提名CsCOPT4作为进一步研究的候选基因。
**研究背景与立项依据**
由Xanthomonas citri subsp. citri（Xcc）引起的柑橘溃疡病可危害叶片、枝梢和果实，导致过早脱落和果实品质下降。铜基喷雾仍是重要的防治手段，但不同制剂间效果存在差异；Xcc中铜抗性遗传决定因子已被鉴定，长期施铜还引发土壤累积与非靶标生物危害的担忧，不利条件下柑橘组织也可能遭受铜害，且不同砧木对过量铜的生理响应存在差异。果园中病害压力还受降雨、风及局部屏障影响。已有替代抑制Xcc的途径被探索，但铜制剂仍具实际应用价值，因此评估单个产品及施用途径需同时关注抗菌活性与植株表现。铜在植物中还具有超越直接抗菌作用的防御功能，拟南芥中Cu
2+响应信号可诱导乙烯生物合成基因ACS8，后续工作鉴定了参与该响应的CPK3–bHLH107–HY5调控模块；病原诱导的核铜伴侣蛋白亦参与PR1表达及对Pseudomonas syringae的抗性。这些发现将铜稳态与免疫联系起来，并引出商业铜制剂是否在柑橘中引发类似响应的问题。植物铜分配涉及COPTs、重金属ATP酶（HMAs）和黄色条纹样蛋白（YSLs）等多个转运蛋白家族。COPTs为保守蛋白，参与铜吸收与细胞内分配；拟南芥COPT1参与根部铜获取，COPT5参与细胞内铜再动员，COPT6影响缺铜下的铜分布；水稻中COPT1与COPT5在Xanthomonas oryzae pv. oryzae侵染时与感病蛋白XA13互作。柑橘COPT基因是否对不同商业铜制剂产生差异响应、各家族成员是否影响叶片中Xcc生长尚不清楚。此前已有研究考察硫森铜对柑橘溃疡病的防治，本研究首先在平板扩散与灌根试验中筛选16种含铜商业制剂，随后重点考察硫森铜，因其在琼脂上无可见抑菌圈却在灌根后降低Xcc生长，并以常规铜制剂波尔多液作为生理性状与组织铜浓度的对照；最后测定枳中PtCOPT基因的转录响应，并在甜橙叶片中瞬时过表达6个对应CsCOPT基因以检验其是否影响Xcc生长。
**主要关键技术方法**
研究人员采用平板扩散法对16种含铜商业制剂进行初步筛选（单次实验、未独立重复、抑菌圈未作统计比较）；以灌根方式处理盆栽‘大红’甜橙与枳幼苗，按标称总铜浓度（mM）施药，于接种Xcc菌株DL509后不同时间点取样，采用叶盘匀浆梯度稀释平板计数测定细菌种群；测定叶绿素指数（乙醇提取、比色）、植株生长参数（侧根数、根长、鲜重、株高）及组织总铜（ICP-AES）；采用qRT-PCR（EF1α为内参、2
?ΔΔCt法）分析PtCOPT转录本；通过农杆菌介导在甜橙叶片瞬时过表达CsCOPT1–CsCOPT6并检测Xcc种群；构建12个柑橘COPT蛋白的最大似然系统发育树；统计分析在R 4.4.2中完成，包括单因素方差分析、Tukey’s HSD、Dunnett检验及Benjamini–Hochberg校正等。样本队列来源为温室内培育的枳与‘大红’甜橙实生苗。
**研究结果**
2.1 商业含铜制剂抗Xcc的平板扩散筛选：对16种制剂进行平板扩散筛选，较高浓度下Kocide 3000、氯溴异氰尿酸–硫酸铜制剂、乙酸铜和琥珀酸铜产生相对较大的抑菌圈；而硫森铜、噻唑铜、喹啉铜和松香酸铜在相同条件下未产生超出滤纸片的可见抑菌圈。由于产品在铜含量、溶解度、化学有效性及复配活性成分上不同，该结果比较的是作为产品的商业制剂，不能单纯归因于铜形态或有机/无机分类；4种产品还含非铜活性成分，其抑菌圈不能仅归因于铜。该平板试验为单次初步实验，无独立重复，抑菌圈数值未作统计比较。
2.2 灌根筛选鉴定降低甜橙Xcc种群的制剂：对16种制剂在甜橙幼苗上按每产品3个浓度灌根筛选，于接种后4和8天测定Xcc种群、14天拍照症状。部分产品在各测试浓度下抑制效果微弱或不一致；而碱式氯化铜、波尔多液、硫森铜和噻唑铜在最高测试浓度下降低Xcc种群，其中硫森铜与噻唑铜在8天时处于最低水平。随后在0.3、0.6和1 mM标称总铜下比较硫森铜与波尔多液，硫森铜在各测试浓度下降低细菌生长，且其效应在较波尔多液更早的采样点即可检出。因平板与灌根结果的反差，选择硫森铜进行后续分析，并以波尔多液为常规对照。
2.3 硫森铜降低枳中Xcc生长：在枳上测试两种制剂，1 mM标称总铜下硫森铜相对于水对照降低Xcc种群；0.1 mM下硫森铜与对照无差异。波尔多液在0.1或1 mM下均与对照无差异，且1 mM波尔多液与1 mM硫森铜无显著差异。
2.4 硫森铜与波尔多液对柑橘幼苗叶绿素指数与生长性状的差异效应：在‘大红’甜橙根部处理后测定叶绿素指数，7天时1 mM硫森铜相对于对照提高叶绿素指数，而4 mM波尔多液降低之，包括1 mM波尔多液在内的其他处理与对照无差异；30天时0.1和1 mM硫森铜相对于对照提高叶绿素指数，4 mM波尔多液降低之，4 mM硫森铜及0.1和1 mM波尔多液与对照无差异。在枳处理后14天考察生长性状：0.1 mM下硫森铜增加侧根数与根长，波尔多液增加鲜重与株高，其他性状与对照无差异；1 mM下硫森铜亦相对于对照增加根长；1 mM波尔多液相对于0.1 mM硫森铜降低侧根数、主根长、鲜重与株高，亦相对于0.1 mM波尔多液降低侧根数、鲜重与株高，并相对于1 mM硫森铜降低侧根数、根长与株高，这些降低与对照无显著差异。
2.5 硫森铜与波尔多液处理后的组织铜积累：测定‘大红’甜橙叶片总铜，7天时4 mM波尔多液相对于对照及4 mM硫森铜提高叶片铜，0.1和1 mM波尔多液与对照无差异，各浓度硫森铜均未提高叶片铜；30天时1和4 mM波尔多液相对于对照提高叶片铜，0.1 mM波尔多液及各硫森铜处理与对照无差异，4 mM波尔多液与4 mM硫森铜无显著差异。另在枳处理后7天测定叶、茎、根总铜：叶片中1 mM波尔多液铜最高并超过所有其他组，0.1 mM硫森铜高于对照与0.1 mM波尔多液，1 mM硫森铜高于0.1 mM波尔多液但与对照或0.1 mM硫森铜无差异，对照与0.1 mM波尔多液无差异；茎中0.1和1 mM硫森铜相对于对照与0.1 mM波尔多液提高铜，1 mM波尔多液与任何组无差异；根中1 mM硫森铜相对于所有其他组提高铜，其他两两差异不显著。
2.6 PtCOPT基因的铜响应表达及柑橘COPT基因在Xcc侵染响应中的候选作用：测定枳根部处理后7天叶与根中PtCOPT转录本水平，每种制剂设各自水对照。叶片中，硫森铜处理下COPT2和COPT4在0.1和1 mM下降低、COPT3在1 mM下降低、COPT5在0.1和1 mM下升高；波尔多液处理下COPT2和COPT3在0.1和1 mM下降低、COPT4在1 mM下降低。根中，硫森铜处理下COPT2在0.1和1 mM下降低、COPT3和COPT5在1 mM下降低；波尔多液处理下COPT2在0.1和1 mM下降低、COPT3在0.1 mM下降低、COPT4在0.1和1 mM下降低。COPT1和COPT6在两组织中均无显著响应。为评估对应甜橙COPT基因是否影响Xcc生长，在甜橙叶片中分别瞬时过表达CsCOPT1–CsCOPT6，各构建体均相对于空载体对照提高其靶基因转录水平；6个基因中仅CsCOPT4过表达与显著较低的细菌种群相关，CsCOPT3与EV-A无差异，CsCOPT6与EV-B无差异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，硫森铜在平板与灌根试验间的错配最为明显：其在滤纸片周围无可见抑菌圈，却在根部施用后降低Xcc种群，制剂影响分散与琼脂扩散的特性可能有助于解释这一差异，灌根响应还可能涉及寄主变化。16产品筛选应理解为测试条件下商业制剂的比较，而非铜化学形态的受控比较；由于各产品测试铜浓度并不完全一致，最高测试浓度下的效力不应解释为产品内在排序；研究使用Xcc菌株DL509，浸润接种绕过了自然侵入途径，果园表现仍有待在不同天气与暴露条件下评估。两种制剂产生不同的生理响应，且依赖寄主物种与采样时间：甜橙中硫森铜在若干处理下提高叶片叶绿素指数而无叶片总铜显著增加，波尔多液则导致更高叶片铜积累并在较高浓度下降低叶绿素指数；叶绿素指数仅为一项生理指标，光合响应还依赖热等环境条件；过量铜可扰乱植物代谢与生长；组织总铜测定可能包含表面滞留铜，不能解析吸收或再分配速率。关于CsCOPT4，拟南芥研究将金属转运与植物防御联系起来，本研究中根施铜制剂改变了枳中PtCOPT表达模式，而对应甜橙COPT基因则通过瞬时过表达单独评估，这些实验涉及不同物种与实验体系；在12个柑橘COPT蛋白的无根最大似然树中，5对（COPT2–COPT6）形成有支持度的姐妹对，COPT1未形成有支持的配对，其对应关系仍基于注释；PtCOPT5显示处理相关表达模式，但CsCOPT5过表达未在甜橙中产生明确抗性表型；由于未实验测定扩增效率，PtCOPT转录本丰度的微小差异应谨慎解释；仅CsCOPT4过表达与较低Xcc种群相关，这些结果将CsCOPT4鉴定为柑橘防御进一步研究的候选，其对硫森铜介导保护作用的贡献尚待确立。结论部分译为：在所考察的16种商业制剂中，硫森铜在平板扩散试验中未产生可见抑菌圈，但根部施用后降低Xcc种群；硫森铜与波尔多液在所测试的柑橘物种中对叶绿素指数、幼苗生长和组织铜浓度的影响亦存在差异；CsCOPT4在甜橙叶片中的瞬时过表达伴随Xcc生长降低，将该基因鉴定为 further study 的候选。
