《Plants》：Genome-Wide Identification of the NAC Gene Family and Expression Analysis Under Contrasting Salinity in Zostera marina L.
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鳗草（*Zostera marina* L.）是一种暴露于显著盐度波动的海洋被子植物，然而与其盐度适应响应相关的转录机制仍未完全阐明。为表征NAC转录因子家族及其在盐度响应中的潜在作用，研究人员在*Z. marina*中开展了全基因组鉴定、系统发育、结构、复制
鳗草（*Zostera marina* L.）是一种暴露于显著盐度波动的海洋被子植物，然而与其盐度适应响应相关的转录机制仍未完全阐明。为表征NAC转录因子家族及其在盐度响应中的潜在作用，研究人员在*Z. marina*中开展了全基因组鉴定、系统发育、结构、复制、启动子及表达分析，随后进行了定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证。共鉴定出63个ZmNAC基因，并划分为6个系统发育组。大多数编码蛋白含有保守的N端NAC结构域，但在长度、基序组成、基因结构和预测亚细胞定位方面差异较大。复制分析将55个基因归类为分散复制，7个为全基因组复制（WGD）或片段复制，1个为近端复制。启动子分析鉴定出64种顺式作用元件类型，主要与光、植物激素和胁迫响应相关。对根、茎、叶在0‰、24‰和40‰ NaCl浓度下处理24 h后进行RNA-seq分析，揭示了ZmNAC家族成员间存在明显的盐度和组织依赖性表达模式。通过qRT-PCR评估的4个候选基因在叶片中的表达模式与RNA-seq结果基本一致。这些发现揭示了ZmNAC家族内的结构和表达多样化，并为鳗草盐度响应的进一步功能研究鉴定了候选基因。
一、研究背景与意义
盐度胁迫通过渗透胁迫、离子毒害、氧化损伤、代谢紊乱、养分失衡和光合抑制等综合效应深刻影响植物生长发育，严重时可导致植株死亡。陆生植物的生理适应、代谢调控网络及耐盐机制已得到广泛研究，但海洋被子植物环境适应的分子基础仍认识不足。鳗草（*Zostera marina* L.）为泽泻目大叶藻科代表性多年生海草，广泛分布于北半球。在沿海和河口生境中，降水、河流排放和地表径流可引起盐度快速变化，低盐可影响鳗草的存活、生长、光合作用和生理表现，因此低盐是具生态意义的挑战。作为少数重返海洋的被子植物之一，鳗草经历了从陆生到海洋环境的进化转变，伴随陆生植物相关基因（如乙烯生物合成和气孔发育相关基因）的丢失，基因组重塑亦促成了其独特的耐盐和对海洋环境适应机制。全基因组测序和比较基因组研究揭示了细胞壁组分硫酸化、光合膜蛋白结构优化等适应性进化特征，并强调了关键基因家族（如查尔酮合酶CHS和叶绿体NADH脱氢酶样NDH复合体）内的功能分化。然而，鳗草响应盐度变化的转录调控网络仍不完全清楚。
转录因子（TFs）是通过结合靶基因启动子中的顺式作用元件调控靶基因表达的蛋白质。NAC家族是最大的植物特异性转录因子家族之一，在植物生长发育和胁迫响应中具有重要作用。NAC蛋白通常由保守的N端NAC结构域和高变异的C端转录调控区组成，NAC结构域约含150个氨基酸，分为5个亚结构域（A–E），主要介导DNA结合、蛋白二聚化和核定位；C端转录调控区序列多样性大，是转录激活或抑制的关键决定因素。NAC转录因子通过识别和结合靶基因启动子中的NAC识别序列（NACRSs）或NAC结合位点（NACBSs）调控下游基因表达，参与器官发育、侧根形成、叶片衰老、木质部发育、种子成熟和激素信号等生物学过程，并在盐、干旱、冷、热、淹水和病原侵染等生物与非生物胁迫响应中具有重要调控作用。已有研究表明，NAC转录因子通过调控离子稳态、渗透调节物质积累、活性氧（ROS）清除和脱落酸（ABA）等植物激素信号通路协调盐胁迫适应响应；部分NAC成员调控离子转运相关基因（包括SOS途径和Na?/H?反向转运蛋白NHX家族）的表达，促进脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质积累，增强超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性。在其他海草中，转录组和群体基因组研究已鉴定出组织特异性调控程序及与发育或环境适应相关的候选位点，凸显了在海洋被子植物中考察特定转录因子家族的必要性。NAC基因家族的全基因组鉴定和功能表征已在拟南芥、水稻、大豆、玉米和棉花等陆生植物中开展，其耐盐、耐旱等作用已被广泛证实。此前一项广泛的比较调查报道鳗草含62个NAC成员，但未考察其在海洋环境适应中的调控作用，尤其是高盐条件下的作用亦缺乏系统研究。为填补这些空白，研究人员利用全基因组数据鉴定鳗草NAC转录因子并开展综合分析，旨在表征鳗草NAC基因家族的进化特征并探索其在海洋环境适应中的潜在作用，为NAC基因的功能验证和鳗草耐盐分子调控机制的进一步研究奠定基础。
二、关键技术方法
研究人员利用TBtools v2.485，以拟南芥NAC蛋白序列为查询序列对鳗草蛋白数据库进行BLASTp检索（E值阈值<1×10??），同时以Pfam v38.2中保守NAC结构域（PF02365）的HMM谱进行HMMER hmmsearch检索，取交集去重后经InterPro v108.0验证NAC/NAM相关结构域特征，鉴定鳗草NAC家族成员；采用IQ-TREE构建最大似然系统发育树（1000次超快自举重复），并用MEME、NCBI CD-Search、TBtools进行基序、结构域和基因结构分析；利用MCScanX进行种内和种间共线性分析及基因复制类型划分，并以Simple Ka/Ks Calculator计算非同义/同义替换率比值；提取翻译起始位点上游2000 bp启动子序列，经PlantCARE预测顺式作用元件；以采自中国威海双岛湾（37°28′ N，121°58′ E）的鳗草植株为材料，经24‰ NaCl驯化72 h后设置对照（CK，24‰ NaCl）、低盐（LS，0‰ NaCl）和高盐（HS，40‰ NaCl）处理，处理24 h后分别采集根、茎、叶组织（每处理3个独立生物学重复），进行RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000平台，150 bp双端测序）和qRT-PCR验证（以Actin11为内参基因，2?ΔΔCt法计算相对表达量）。
三、研究结果
2.1 ZmNAC家族基因的鉴定
通过TBtools v2.485中的BLAST和HMMER（PF02365）检索，并经Pfam验证，在鳗草中鉴定出63个NAC基因，命名为ZmNAC1–ZmNAC63，不均分布于基因组，1号染色体数量最多，ZmNAC57–ZmNAC63位于未锚定支架上。基于63个ZmNAC蛋白序列用IQ-TREE构建的系统发育树将ZmNAC蛋白分为6个系统发育组（I–VI组），分别含14、5、9、17、14和4个基因。将63个ZmNAC与141个水稻NAC蛋白序列联合建树，分为7个系统发育组，I–VI组与仅基于鳗草的6组对应并含两物种NAC成员，VII组仅含水稻NAC成员。63个预测ZmNAC蛋白长度为66–1196个氨基酸，分子量7667.76–134379.92 Da，理论等电点4.14–9.90，不稳定性指数26.77–59.43（26个低于40，预测较稳定），脂肪族指数44.43–115.00，GRAVY值?1.048–0.102（59个为负值，以亲水性为主）。亚细胞定位预测显示多数ZmNAC蛋白定位于细胞核，部分定位于细胞质、叶绿体、过氧化物酶体和线粒体。ORF完整性分析显示全部63个ZmNAC编码序列均含规范ATG起始密码子和框内终止密码子，无内部提前终止密码子；5个非典型基因模型（ZmNAC22、ZmNAC37、ZmNAC59、ZmNAC60和ZmNAC63）亦具完整注释ORF，但暂标记为低置信度；剔除这5个非典型模型后重建系统发育树，拓扑结构和主要分组模式未变，支持家族层面结论的稳健性。
2.2 ZmNAC家族基因的保守基序、结构域和基因结构分析
MEME分析鉴定出ZmNAC蛋白中的多个基序，基序1–6存在于多数成员中且主要集中于N端区域，与保守NAC结构域大幅重叠；所有保留候选均检测到NAC/NAM相关特征，但结构域完整性和构架各异，C端区域序列变异大，提示其对家族内功能分化的潜在贡献。外显子结构分析显示ZmNAC基因变异大，外显子数目为1–12个，III组成员外显子一般多于其他组。多序列比对进一步勾勒出5个NAC亚结构域（A–E），多数ZmNAC蛋白保留相对完整的保守N端区域。
2.3 ZmNAC家族基因的基因复制事件与共线性分析
种内共线性分析鉴定出3对共线基因对：ZmNAC21-ZmNAC45、ZmNAC20-ZmNAC41和ZmNAC28-ZmNAC49，染色体间（含2、3、4号染色体）观察到广泛的全基因组共线关系。种间共线性分析比较鳗草与拟南芥、玉米、水稻、小麦和甘蔗R570，分别鉴定出6、15、30、35和38对共线基因对，涉及6、11、16、14和10个不同ZmNAC基因，这些基因主要位于1、2、3和5号染色体。63个ZmNAC基因分为3种复制类别：55个为分散复制，7个为WGD或片段复制，仅ZmNAC42为近端复制，未鉴定到串联复制，表明分散复制是ZmNAC家族最主要的复制类别。Ka/Ks分析显示ZmNAC20-ZmNAC41、ZmNAC21-ZmNAC45和ZmNAC28-ZmNAC49三对共线基因对的比值分别为0.21069、0.15197和0.089283，均小于1，与纯化选择主导这些重复基因对相一致。
2.4 ZmNAC家族基因启动子顺式作用元件分析
提取启动子序列分析顺式调控元件，共鉴定出64种顺式作用元件类型，涉及31种推定调控功能，分为光响应、植物激素响应、胁迫响应及其他生长发育相关过程四大类。光响应元件高度多样，如G-box、GT1-motif和Box 4；激素响应元件与生长素、茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸和脱落酸信号相关，ZmNAC启动子中共检测到176个推定ABRE，为本数据集中检测频率最高的激素响应元件类型之一；胁迫响应元件包括DRE、WUN-motif、LTR、MBS、ARE和TC-rich repeats等，另检测到MBS、MRE和MBSI等MYB结合元件。各ZmNAC启动子中预测顺式作用元件的组成和出现情况各异，表明其推定调控构架存在异质性。
2.5 对比盐度条件下ZmNAC家族基因的表达分析
RNA-seq分析揭示盐度处理后根、茎、叶中ZmNAC表达的变异。高盐处理下，ZmNAC17、ZmNAC23和ZmNAC42在全部3种组织中相对表达趋势高于相应对照，三者均属I组；总体上I组成员在根和茎中相对表达较高，II组成员大多较低；ZmNAC44在高盐下根和茎中相对表达亦高于对照，呈组织依赖性响应。低盐处理下，ZmNAC1、ZmNAC18、ZmNAC24和ZmNAC50在全部3种组织中相对表达高于相应对照，表明处理24 h后ZmNAC家族存在明显的盐度和组织相关表达谱。对独立植株叶片中ZmNAC17、ZmNAC36、ZmNAC39和ZmNAC42的qRT-PCR分析显示其表达模式与RNA-seq基本一致。
四、讨论与结论
NAC转录因子广泛参与植物生长发育、激素信号和非生物胁迫响应，是环境适应调控网络的重要组成部分。本研究鉴定的63个ZmNAC基因与先前报道的62个成员的细微差异可能反映基因组注释版本和基因鉴定程序的差异，鳗草基因组注释已从v2.1更新至v3.1，可改变基因模型、合并或拆分基因座并改变预测蛋白编码基因总数。按蛋白编码基因数归一化后，鳗草约每1000个蛋白编码基因含2.93个NAC候选（63/21483），低于拟南芥的约3.83（105/27416）和玉米的约3.75（148/39498），无论绝对数量还是归一化后均小于拟南芥、玉米等陆生植物，除基因组大小和倍性差异外，这种变异可能与鳗草独特的进化历史有关——其由陆生被子植物祖先重新定居海洋环境并经历广泛基因组变化，与陆生生活相关的若干基因（如气孔发育、挥发性萜烯生物合成和紫外防护相关基因）已丢失或修饰，细胞壁、离子转运和渗透调节相关基因亦在适应海水过程中被修饰，因此其NAC家族成员相对较少可能与其独特基因组进化史相关。ZmNAC蛋白总体保留了NAC转录因子的特征结构，多数成员含相对保守的N端NAC结构域（基序1–6集中于此），C端序列变异大，符合同组内基序组成和基因结构相似的规律，但外显子数和蛋白长度存在相当变异，提示核心NAC构架保守的同时发生了结构多样化；部分ZmNAC蛋白（如仅约66 aa的ZmNAC22、ZmNAC59、ZmNAC60和ZmNAC63）存在蛋白长度或结构域完整性的差异，基因复制后一份拷贝可保留祖先功能而另一份承受松弛选择压力并更易累积缺失、插入和提前终止密码子等突变，逐渐产生缺失部分结构域的蛋白，持续累积破坏性突变可损害编码能力而产生假基因或截短基因，但部分结构丢失不一定导致蛋白完全失活，而可能改变DNA结合、蛋白互作、亚细胞定位或转录激活/抑制特性，产生不同的调控特性，但这些也可能是截短模型或注释假象。保守N端NAC结构域通常含核定位信号（NLSs），多数ZmNAC蛋白预测定位于细胞核与其作为转录因子的分子角色一致，但NAC蛋白并非仅定位于细胞核，部分成员可能存在于细胞质、质膜或细胞器中，尤其膜结合NAC转录因子（NTLs）含C端跨膜结构域，初始锚定于膜上，受环境或发育信号诱导后释放并转位至细胞核调控靶基因表达，少数预测定位于细胞质、叶绿体、线粒体等区室的成员可能参与信号转导、光合作用或氧化还原稳态等过程，但核与非核成员的预测均需实验确认。系统发育分析在联合树中将NAC成员分为7组，仅含OsNAC基因的VII组出现在联合树中，提示这些NAC家族进化过程中的谱系特异性扩张、保留或丢失，但当前证据不足以确定该差异是否由鳗草对海洋环境的适应直接驱动；睡莲（*Nymphaea colorata*）中亦有相对较小的NAC基因家族报道，需对其他海草和泽泻目近缘种进行更广泛取样，并结合基因组大小和基因含量感知的比较，才能确定水生谱系在NAC基因相对代表性上是否表现出一致差异。基因复制是植物转录因子家族扩张和功能分化的重要来源，本研究多数ZmNAC基因归类为分散复制、少数为WGD或片段复制，表明分散复制在ZmNAC家族进化中起主导作用，杜鹃（*Rhododendron delavayi*）中亦有分散复制驱动NAC家族扩张的报道；对24个陆生植物物种NAC家族的比较研究发现WGD事件较多的物种通常NAC家族较大，复制和保留历史的差异可能有助于解释NAC家族大小的变异，但仍需进一步验证。ZmNAC基因与拟南芥、玉米、水稻、小麦和甘蔗R570同源基因间检测到共线关系，与单子叶植物相比拟南芥普遍鉴定出更多共线基因对，与鳗草在单子叶植物中的系统发育位置一致，基因对数目亦受倍性、复制历史、基因保留及组装和注释质量影响，尤其小麦为异源六倍体、甘蔗R570具复杂多倍体杂合基因组；ZmNAC1在全部5个物种中均有共线对应基因，ZmNAC10、ZmNAC12、ZmNAC13、ZmNAC14和ZmNAC34在多个单子叶物种中亦有共线同源基因。预测的启动子顺式作用元件组成为ZmNAC基因的潜在上游调控提供线索，ZmNAC启动子中鉴定出大量与光、植物激素和环境胁迫响应相关的顺式作用元件；光响应元件参与光驯化和光周期依赖响应等生理过程调节，在睡莲等多个物种中光响应元件是NAC基因启动子中的主要顺式作用元件，拟南芥中ANAC078过表达在高光下增加类黄酮生物合成，光信号亦通过光受体介导的COP1/SPA–HY5途径调控类黄酮代谢，拟南芥、小麦等植物NAC转录因子参与ABA相关胁迫调控途径，这些发现促使考察鳗草中光相关调控，但ZmNAC基因上游光响应元件是否调控类黄酮生物合成仍需进一步实验验证，ABRE等预测的激素和胁迫响应基序亦为启动子试验提供候选，这些预测应通过启动子-报告基因试验和功能研究加以检验。RNA-seq分析揭示ZmNAC家族内明显的盐度和组织依赖性响应，水稻中不同OsNAC基因对盐胁迫响应差异显著（100 mM NaCl处理下部分基因3 h上调而6 h受抑，另一些呈相反模式），大蒜AsNAC基因在盐处理后1、4和12 h亦呈不同表达模式且根叶间存在差异，提示NAC家族基因间存在动态功能特化；高盐和低盐下不同基因集的诱导提示鳗草可能采用不同的NAC调控模块分别响应盐度升高和降低，而非依赖单一梯度响应。高盐下ZmNAC17、ZmNAC23和ZmNAC42在3种组织中相对表达均较高，低盐下ZmNAC1、ZmNAC18、ZmNAC24和ZmNAC50呈此模式；ZmNAC1与拟南芥SND3（AT1G28470.1）同源，后者主要参与纤维和木质部细胞的次生细胞壁形成，其过表达促进纤维细胞次生壁增厚，低盐下ZmNAC1在根、茎、叶中相对表达较高，低盐改变跨细胞膜渗透平衡并可能导致水分内流和细胞膨压变化，ZmNAC1的诱导可能与细胞壁重塑或维持细胞机械稳定性相关，值得进一步检验。重复基因并不总是保留相似表达模式，被归为WGD或片段复制类型的共线基因对ZmNAC28和ZmNAC49在根中呈相反的盐度依赖表达趋势，ZmNAC28在低盐下相对表达最高而ZmNAC49在高盐下最高，其启动子顺式作用元件组成亦有差异，提示两基因在复制后可能演化出不同的盐度响应而保留部分序列和结构保守性，上游调控区的变化可能促成了这种调控分化，有趣的是两基因在茎中表达一致。系统发育相关的ZmNAC成员对盐胁迫的响应并不必然相同，如VI组成员ZmNAC1、ZmNAC8、ZmNAC33和ZmNAC55在高盐下呈不同的组织相关表达模式，其预测启动子顺式作用元件组成亦有差异；类似地，重复基因对ZmNAC28-ZmNAC49表现出相反的盐度响应，提示系统发育或结构保守性并不必然预测相似的转录响应，基因复制后启动子区的分化可能与ZmNAC家族基因间不同的盐度和组织依赖性响应相关。ZmNAC44在高盐下根和茎中相对表达亦较高，其拟南芥同源基因AT1G77450.1参与水杨酸/茉莉酸信号和根生长调控，提示激素相关调控可作为未来研究的假设；表达和比较基因组证据支持优先对ZmNAC44等响应成员进行功能试验，但其具体调控作用仍未阐明。上述发现提示ZmNAC家族基因可能参与鳗草的盐度响应，但本研究基于单一24 h处理和单一位点、单一季节的采样，这些响应的时间动态及在中等自然盐度波动下的普遍性仍有待确定；此外qRT-PCR验证仅限叶片和单一内参基因，这些基因在不同组织中的具体功能尚未阐明，未来工作应纳入多个时间点、更广的盐度范围和功能试验，以系统研究ZmNAC基因在鳗草盐度适应中的作用。
结论部分译文：本研究表征了鳗草中的63个NAC基因。该家族表现出保守的NAC结构特征、以分散复制为主以及多样的启动子和表达谱。在短期盐度处理下，ZmNAC17、ZmNAC23和ZmNAC42在高盐下于根、茎、叶中相对表达较高，而ZmNAC1、ZmNAC18、ZmNAC24和ZmNAC50在低盐下呈相似趋势。这些基因为功能研究候选。需要在更多时间点和代表性盐度条件下开展实验以检验其在鳗草盐度响应中的作用。
