《Toxins》：Defining Purity in Botulinum Neurotoxin Type A Formulations: A Narrative Review on Past and Future Developments
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A型肉毒神经毒素（BoNT/A）已成为当今治疗与美容应用中使用最广泛的生物制剂之一。在BoNT/A应用的创新探索之外，其生产制造与制剂工艺也取得了诸多进展。对“纯”BoNT/A的最初定义是指成功从肉毒梭菌（Clostridium botulinum）中分离出天
A型肉毒神经毒素（BoNT/A）已成为当今治疗与美容应用中使用最广泛的生物制剂之一。在BoNT/A应用的创新探索之外，其生产制造与制剂工艺也取得了诸多进展。对“纯”BoNT/A的最初定义是指成功从肉毒梭菌（Clostridium botulinum）中分离出天然神经毒素复合物，这为其临床开发奠定了基础。此后，“纯度”一词被赋予了多种不同的定义，涵盖科学、监管、临床及商业层面的不同解读。制剂领域的进步最初侧重于去除无毒的细菌成分，以降低蛋白质负荷和免疫原性。SDS-PAGE和ELISA等分析方法也日益被用于支持BoNT/A的身份和数量声明并定义纯度；然而，这些方法提供的生物活性相关信息十分有限。鉴于BoNT/A并非单一均一的分子实体，菌株差异、生产工艺差异以及复合蛋白的有无导致产生了不同的产品制剂，进一步使纯度的直接比较复杂化。本综述审视了BoNT/A纯度的各种操作性定义，讨论了其对临床医师和患者的影响，并着重介绍了通过标准化且具有生物学相关性的效价测定方法来提高产品可比性的新兴科学与监管努力。
1. 引言
A型肉毒神经毒素（BoNT/A）通过裂解神经元细胞膜胞质侧的SNARE复合物关键组分SNAP-25，阻止突触囊泡的停靠与融合，从而抑制神经递质释放。其发现源于与污染血肠相关的食源性肉毒中毒事件，随后由眼科医生Alan Brown Scott率先认识到其诱导暂时性局部肌肉麻痹的潜力，并用于治疗斜视等肌肉过度活动相关疾病。自1989年首次获批用于斜视和眼睑痉挛以来，BoNT/A的适应症不断扩展，涵盖颈肌张力障碍、上肢痉挛、偏头痛、泌尿系统疾病、胃肠道疾病以及皮肤美容领域。近年来，全球特别是亚太地区BoNT/A产品数量显著增加，市场预计将持续增长。与此同时，关于“纯”BoNT/A的不同定义也随制造、科学、监管及商业发展而演变，这些定义不可互换，对临床医师和消费者具有不同含义。
2. BoNT/A产品纯度的定义
BoNT/A产品纯度概念经历了多个层面的演变，涉及科学、监管、临床和商业的不同解读。
2.1 从肉毒梭菌中分离天然BoNT/A复合物
最初“纯化”BoNT/A的概念是指从肉毒梭菌（C. botulinum）细胞培养物中成功提取天然神经毒素复合物。Edward Schantz建立的批量分离方案通过多次沉淀、洗涤及最终结晶获得纯化毒素。在酸性条件下，核心150 kDa神经毒素与非毒蛋白非共价结合形成复合物，如900 kDa前体复合物，其中包含非毒非血凝素蛋白（NTNH）和多拷贝血凝素（HA-17、HA-33、HA-70）。首个市售产品onabotulinumtoxinA（Botox?）基于Schantz沉淀法生产，而abobotulinumtoxinA（Dysport?）采用色谱柱纯化，形成约300 kDa和500 kDa的复合物。不同产品的复合物分子量差异源于活性150 kDa神经毒素所结合辅助蛋白的数量不同。
2.2 去除无毒的细菌成分
随着BoNT/A商业化，长期反复注射后因中和抗体（NAbs）导致的继发性治疗失败引发关注。非毒复合蛋白、鞭毛蛋白及梭菌DNA等细菌成分被认为可能增加免疫原性。incobotulinumtoxinA（Xeomin?）是首个以最小化外源蛋白负荷为目标开发的产品，不含复合蛋白，其150 kDa活性双链蛋白常被称为“裸神经毒素”或“纯”制剂。临床前研究显示复合蛋白可能增强中和抗体反应，但临床数据存在异质性。目前行业整体趋向于开发不含复合蛋白的制剂。最新的进展是利用重组蛋白技术，例如以大肠杆菌（E. coli）表达系统生产150 kDa BoNT/A，但需关注宿主细胞来源的杂质如脂多糖（LPS）的清除。首个获批的重组BoNT/A产品YY001（Retoxin）已通过III期临床试验证实其非劣效性。
2.3 BoNT/A的理化鉴定与定量
随着产品及适应症增加，SDS-PAGE、体积排阻高效液相色谱（SE-HPLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等分析方法常用于BoNT/A的定量与鉴定，并被视为“分析纯度”指标。不同监管机构对此要求存在差异，例如韩国食品药品安全部建议将SE-HPLC或SDS-PAGE作为纯度测试方法，而欧洲药典将其归为蛋白质身份图谱评估。然而，这些方法无法区分结构完整但功能失活的BoNT/A（如未裂解为双链形式或错构的轻链）。失活毒素可增加产品抗原性，但市售产品中失活蛋白含量各异。部分营销材料引用“纯度98%”或“95%”等数据，但这些数值缺乏生物学相关性，可能误导消费者。此外，这些方法不能识别其他成分，如高阶蛋白聚集体，可采用SEC-MALS进行补充表征。效价（以单位表示）通常通过小鼠致死试验或细胞基效价测定法评估，比活性（单位/ng）可反映生物活性与蛋白量之间的关系，是更具信息价值的指标。
3. 临床医师与消费者视角
3.1 临床医师视角
“纯”BoNT/A产品的发展为临床实践提供了更多选择，尤其是降低蛋白负荷和免疫原性对长期反复注射或大剂量使用的患者尤为重要。对于发生继发性无应答的患者，换用不含复合蛋白的制剂常被推荐。一项荟萃分析显示，仅使用不含复合蛋白的incobotulinumtoxinA治疗的患者未检测到NAbs。目前，色谱纯度等分析指标不能直接转化为临床相关终点，比活性是更具参考价值的指标。
3.2 消费者视角
寻求美容治疗的患者常通过社交媒体等现代渠道获取产品信息，但这些信息可能强调“干净”或“更纯”等营销描述，导致认知混淆。一项涉及363名亚太地区美容患者的调查显示，61%的受访者误以为所有BoNT/A制剂都不含复合蛋白。此外，部分商业宣传将“纯”与“不含人或动物来源成分”联系起来，如使用非动物来源工艺或替代人血清白蛋白（HSA）稳定剂的产品。HSA具有长期安全性数据，而替代辅料如聚山梨酯可能引发免疫原性和超敏反应，需谨慎评估和长期随访。
4. 未来方向
BoNT/A作为细菌来源产品，缺乏通用效价标准，且非单一分子实体，生产过程高度依赖工艺参数。因此，从功能角度定义纯度愈发重要。目前，公私营部门正在推动标准化效价检测平台的建立，例如2024年5月美国国家转化科学促进中心联合FDA资助开发不依赖动物试验的标准化检测平台，同时更多细胞基效价测定方法正在发展。未来对“纯度”的解释将更关注其与临床疗效和免疫原性的相关性，而非仅基于组成特征。
5. 材料与方法
本叙述性综述通过迭代、非系统的检索策略，利用PubMed、Google Scholar和Embase等数据库，并结合官方监管指南、产品材料及新闻稿，识别相关文献。根据文献中遇到的三种产品纯度操作性定义——（1）天然神经毒素复合物的分离，（2）无毒的细菌成分的去除，（3）BoNT/A的理化鉴定与定量——进行叙述性综合，以阐明科学、监管、临床及商业层面的纯度解读。
