云南干巴菌（Thelephora ganbajun）菌际圈土壤地下环境的多地点地理分化及其与子实体代谢表型的关联

《Journal of Fungi》：Geographic Differentiation of the Thelephora ganbajun Mycosphere Across Multiple Sites and Its Associations with Fruiting-Body Metabolic Phenotypes

　　

干巴菌（Thelephora ganbajun）是一种极具价值的外生菌根食用真菌，但其自然分布与生长同土壤环境条件之间的关系仍认识不足。本研究在中国云南省7个地理地点采集了菌际圈土壤与相邻对照土壤，整合土壤理化性质、酶活性、非靶向代谢组学以及细菌和真菌扩增子测序，以刻画地下环境的地理变异及其与子实体代谢表型的关联。菌际圈土壤与对照土壤之间的养分水平和酶活性存在差异，且差异幅度因地点而异。共注释到5006种代谢物，其中包括在全部7个地点共有的77种差异代谢物，但其变化方向强烈依赖于地点。菌际圈土壤中的细菌和真菌群落表现出显著的地理分化。基于距离的冗余分析前两轴分别累计解释了细菌和真菌群落变异的50.04%和56.73%。土壤pH、碱解氮（AN）和有效磷（AP）是关键环境因子，其中后两者与细菌和真菌群落结构均显著相关。Procrustes分析进一步揭示两个微生物群落具有一致的地理分化。子实体的挥发性、非挥发性及游离氨基酸代谢表型与地下环境的不同组分相关联。上述发现揭示了干巴菌（T. ganbajun）在单一出菇季内地下环境的地理变异及其与子实体代谢表型的关联，为未来生境评估提供了候选环境指标。

一、研究背景与问题

干巴菌（Thelephora ganbajun M. Zang，革菌科）是主要分布于中国云南的珍稀野生食用菌，具有食用、经济和生态价值。与腐生型食用真菌不同，干巴菌为外生菌根真菌，自然条件下依赖与宿主植物根系的共生关系，其菌丝生长、养分获取和子实体形成受宿主植物与土壤条件共同影响，这也在一定程度上解释了干巴菌、松茸、块菌等外生菌根真菌难以实现稳定人工栽培的原因。因此，刻画干巴菌自然生境的土壤生态条件，有助于识别有利于其生长的土壤条件，为野生资源保护与生境管理提供依据。

外生菌根共生以宿主植物与真菌之间的营养互惠为主要特征：宿主提供光合固定的碳，真菌通过根外菌丝从土壤获取氮、磷等养分并部分转移给宿主；哈氏网（Hartig net）是二者养分与代谢物交换的重要界面，根外菌丝则将交换延伸至周围土壤。近年研究表明，外生菌根体系还涉及多种伴生微生物，菌根辅助细菌可促进菌根形成、菌丝生长和养分转化，而外生菌根菌丝可通过提供定殖位点和释放选择性分泌物影响周围微生物。松茸和块菌等外生菌根食用菌的研究已表明，其生长与土壤性质、微生物群落及微生物代谢功能密切相关，且这些地下生态特征受地理环境条件影响。

相比之下，干巴菌的地下生态学认识仍较薄弱。已有研究主要集中于其地理种群的遗传多样性、子实体不同组织区室中微生物群落与功能基因的分布，以及菌丝、原基和子实体发育过程中蛋白质与代谢物的变化。然而，不同地理地点菌际圈土壤与相邻对照土壤在理化性质、酶活性和代谢物谱上是否存在一致差异尚不清楚；不同地点菌际圈代谢物与微生物群落是否兼具共有特征和地点特异性模式也缺乏直接证据；土壤环境条件、酶活性、代谢物与微生物群落之间的关系尚未被系统研究。

二、研究开展与主要结论

基于上述背景，研究人员在云南省7个地理地点（南华NH、易门YM、宜良YL、昌宁CN、凤庆FQ、石屏SP、昆明盘龙区双龙街道SL）开展研究。首先比较菌际圈土壤（RSs）与相邻对照土壤（CSs）在理化性质、酶活性和代谢物组成上的差异，并考察这些差异的地点间变异；随后分析不同地点RSs中细菌和真菌群落组成及其与土壤环境因子的关系；最后整合土壤环境、代谢组和微生物群落数据，探讨各生态维度之间以及这些维度与子实体代谢表型的关联。研究旨在刻画干巴菌相关土壤特征的地理分化及其与子实体代谢表型的关系，为后续生境评估和候选指标验证提供基础。

主要结论为：RS与CS在养分水平、酶活性和代谢物谱上的差异强烈依赖地点；RS的代谢物组成及细菌、真菌群落均表现出显著地理分化；土壤pH、碱解氮（AN）和有效磷（AP）在多项环境关联分析中反复出现，且AN和AP均与细菌和真菌群落结构相关；子实体的挥发性、非挥发性和游离氨基酸代谢表型与地下环境的不同组分相关联，表明地下环境特征与子实体代谢表型之间存在多层次关联。土壤pH、AN、AP及相关代谢物和微生物类群可作为未来生境评估的候选指标，但其指示价值和潜在生态作用仍需进一步验证。

三、主要关键技术方法

研究人员在7个地点各采集3个子实体，每个子实体配对采集1份RS和1份CS，共获得21对RS–CS样品，采样时间为2025年7—9月。土壤理化性质按相关行业标准测定，包括pH、有机质（SOM）、有机碳（SOC）、全氮（TN）、全磷（TP）、全钾（TK）、碱解氮（AN）、有效磷（AP）、有效钾（AK）；酶活性采用商品化试剂盒测定酚氧化酶（PO）、脲酶（S-UE）、过氧化氢酶（S-CAT）、酸性磷酸酶（S-ACP）和几丁质酶；土壤颗粒组成采用激光衍射法测定，矿质元素采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定；非靶向土壤代谢组学采用超高效液相色谱–高分辨质谱（UHPLC–HRMS）分析；细菌16S rRNA基因V3–V4区和真菌ITS2区进行扩增子测序（NovaSeq 6000平台）；子实体同步进行挥发性代谢组学（HS-SPME-GC-MS/MS）、非挥发性代谢组学（UPLC-MS/MS）和游离氨基酸分析。

四、研究结果

3.1 土壤性质、酶活性与颗粒组成：RSs理化性质在各地理地点间差异明显，pH范围为5.01–6.81，均为酸性，SLRS接近中性；CNRS的TN、SOM、SOC、AN、TP和AK最高，YMRS的TK最高（13.665 g kg^?1），SPRS的AP最高（7.225 mg kg^?1）。CSs的pH范围为4.92–5.82。描述性比较显示RS–CS差异因地点而异：FQ和SP的全部8个养分变量均为RS高于CS，FQRS的AP和AK分别约为FQCS的3.62倍和3.98倍，SPRS相应为8.26倍和3.48倍；YMRS和SLRS的多数养分低于对应CSs。RSs酶活性在地点间存在差异，CNRS的脲酶和过氧化氢酶最高，SPRS的酸性磷酸酶和几丁质酶最高；酸性磷酸酶和PO活性在全部7个地点均表现为RS低于CS。颗粒组成与矿质元素亦存在地点差异，SPRS砂粒比例最高（58.26%）且Ca、Mg最高，YMRS砂粒比例最低（11.55%）、黏粒最高（33.15%）。

3.2 土壤代谢组分析：共注释5006种代谢物，RS与CS的主要代谢物类别总体相似，均以有机酸、氨基酸及其衍生物、芳香族与酚类化合物为主；RS中芳香族与酚类、生物碱和萜类比例较高，CS中有机酸、脂质及类脂分子、醇类和胺类比例较高。PCA显示RS和CS代谢物谱均存在地理分化，SLRS明显分离。基于21对RS–CS配对差异谱的PERMANOVA表明地点间差异显著（pseudo-F = 7.83，R² = 0.770，p = 0.001），PERMDISP无显著差异（p = 0.519）。各地点RS–CS配对OPLS-DA的交叉验证Q²为0.9757–0.9964，分类准确率100%，配对内置换检验精确p值为0.25。维恩图显示77种差异代谢物为7个地点共有，SL地点特异性差异代谢物最多（207种），SP最少（71种）；共有代谢物的log₂(RS/CS)热图显示FQ、SP和CN多为正值，YM多为负值。以VIP > 1且p < 0.05筛选出1922种差异代谢物，经BH校正后1915种（99.64%）仍显著；K-means聚类分为3类，分别以YL、CN（最低为YM）和SL标准化水平最高。KEGG富集分析显示显著通路包括β-丙氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸生物合成、苯丙烷生物合成、吲哚生物碱生物合成和嘧啶代谢。202种候选代谢物与土壤变量的Spearman相关分析中，31种与至少一个土壤变量呈强显著相关。

3.3 菌际圈土壤细菌与真菌群落特征：21份RS样品细菌16S测序获2,326,577条高质量序列，97%相似度下得28,369个OTUs；真菌ITS2测序获1,946,902条高质量序列，DADA2去噪得6805个ASVs。细菌门水平以Pseudomonadota、Acidobacteriota、Chloroflexota、Actinomycetota和Planctomycetota为主；真菌属水平主要包括Tomentella、Trichoderma、Umbelopsis、Thelephora、Sebacina等，相对丰度因地点而异。细菌和真菌α多样性指数在7个地点间均显著差异，YLRS的细菌和真菌丰富度与多样性相对较低，SPRS总体较高。基于Bray–Curtis的PCoA显示两类群落结构均存在地理分化，PERMANOVA表明地点间差异显著（细菌R² = 0.968，真菌R² = 0.988，p = 0.001），PERMDISP无显著差异。LEfSe分析（LDA ≥ 4.0）鉴定出10个特征细菌类群和21个特征真菌属，真菌特征属多于细菌。db-RDA显示pH、AN和AP与细菌群落结构显著相关（p = 0.001），AN和AP与真菌群落结构显著相关（p = 0.001），前两轴累计解释率分别为50.04%和56.73%。Mantel检验显示细菌OTU水平群落组成与全部8个环境因子显著相关，真菌ASV水平群落组成与AN、几丁质酶、PO、AP和pH显著相关。

3.4 土壤环境因子、代谢物与微生物群落的关联：特征细菌属与土壤环境变量存在明显关联，如Candidatus Udaeobacter与S-CAT、SOM和AN负相关而与pH正相关，Burkholderia–Caballeronia–Paraburkholderia与S-CAT负相关，Sphingomonas与几丁质酶正相关。特征真菌属亦呈特异关联，如Saitozyma与TN、TP、AN、SOM、SOC和脲酶正相关，Thelephora与TP正相关而与S-ACP负相关。特征细菌属和真菌属分别与候选代谢物存在强关联。Procrustes分析显示细菌与真菌群落排序结构显著相关（M² = 0.5332，p = 0.002），表明二者地理分化一致。子实体代谢表型与地下环境的关系分析显示，挥发性代谢组与土壤代谢组和真菌群落均显著相关，非挥发性代谢组与土壤理化性质、酶活性和真菌群落显著相关，游离氨基酸主要与土壤理化性质相关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，RS与CS代谢物组成存在差异但变化模式因地点而异，与植物根际研究报道的规律相似，但干巴菌相关土壤中单个化合物的来源与转化过程仍待阐明；RS中萜类比例较高可能与微生物互作有关。不同地点RSs的代谢差异主要涉及氨基酸代谢、含氮化合物代谢以及芳香族和次级代谢过程，土壤变量与候选代谢物的相关模式与根际研究一致，但相关分析无法确立具体过程。微生物群落的地理分化中，部分外生菌根真菌类群表现出地点间判别模式，Mortierella等特征类群可能参与难溶性磷的转化，Burkholderia–Caballeronia–Paraburkholderia等在松茸生境土壤中亦为重要细菌类群。土壤pH、AN和AP与微生物群落分化显著相关，且环境条件对整体群落组成的关联强于对部分α多样性指数的关联；LEfSe鉴定的类群代表地点间判别差异，其是否为菌际圈特有仍需结合对照土壤微生物数据进一步分析。子实体不同代谢表型与地下环境不同组分关联，挥发性代谢组与土壤代谢组和真菌群落相关，提示产地香气化合物变异可能与地下化学与生物环境均有关；非挥发性代谢组与土壤理化性质、酶活性和真菌群落相关；游离氨基酸主要与土壤理化性质相关，具体机制尚待研究。生态学意义方面，干巴菌生境的地理差异涉及土壤养分、代谢物谱和微生物群落多个维度而非单一主导因子；pH、AN和AP是未来生境评估的候选因子，其适宜范围及与稳定出菇的关系需进一步验证。研究局限包括：仅覆盖单一出菇季的空间差异，关联主要反映地点间共变并可能受共同地理背景影响；未验证同地点3个子实体的遗传独立性，采样点间距差异可能影响样内异质性与群落差异评估；未系统鉴定宿主植物，也未用种特异性分子检测验证RS中干巴菌菌丝的存在及CS中的缺失或减少，因此RS–CS差异不能解释为已确证的真菌定殖效应；土壤微生物群落存在时间动态，季节变化可能影响真菌群落组装。未来可结合更精细尺度采样、跨年度和跨出菇季的连续监测，并比较持续出菇与出菇衰退区域的地下生态特征。

结论部分译文：本研究表明，云南省7个地点RS与CS之间在养分水平、酶活性和代谢物谱上的差异强烈依赖地点。RS的代谢物组成以及细菌和真菌群落也表现出显著的地理分化。土壤pH、AN和AP在多项环境关联分析中反复出现，其中AN和AP均与细菌和真菌群落结构相关。子实体的挥发性、非挥发性和游离氨基酸代谢表型与地下环境的不同组分相关联，表明地下环境特征与子实体代谢表型之间存在多层次关联。上述发现为理解干巴菌生境的地理变异提供了基础。土壤pH、AN、AP及相关代谢物和微生物类群可作为未来生境评估的候选指标，但其指示价值和潜在生态作用仍需进一步验证。