《Journal of Fungi》：Evaluation of the Zybio EXS2600 Mass Spectrometry for Accurate and Fast Identification of Filamentous Fungi Clinical Isolates
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目的：评价新型Zybio EXS2600 Ex-Accuspec数据库及系统在鉴定临床丝状真菌病原体中的性能，并与现有Bruker Filamentous Fungi Library 3.0数据库及系统进行比较。背景：诊断延迟或不准确可显著增加侵袭性霉菌感染相
目的：评价新型Zybio EXS2600 Ex-Accuspec数据库及系统在鉴定临床丝状真菌病原体中的性能，并与现有Bruker Filamentous Fungi Library 3.0数据库及系统进行比较。背景：诊断延迟或不准确可显著增加侵袭性霉菌感染相关死亡风险。近年来，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定霉菌分离株已超越传统形态学鉴定方法。方法：共分析180株特征明确的临床霉菌分离株，代表11个属23个种，同时分析来自3个属的8株参考菌株。采用直接提取法在EXS2600和Biotyper上进行分析。结果分别采用厂商推荐 cutoff 分值及较低 cutoff 分值进行评价。结果：在180株临床分离株中，采用厂商推荐评分阈值时，EXS2600在种/种复合体水平（57.2% vs. 17.2%）和属水平（82.8% vs. 45.6%）的鉴定率均显著高于Bruker Biotyper（均 p < 0.001）。采用降低的评分阈值时，EXS2600在种/种复合体和属水平的鉴定率分别提高至82.8%和91.7%，而Bruker Biotyper分别为45.6%和66.7%（均 p < 0.001）。EXS2600系统对烟曲霉（Aspergillus fumigatus，80.8%）、黄曲霉（Aspergillus flavus，93.8%）和皮肤癣菌（85.0%）达到较高的种水平鉴定率。相比之下，Bruker Biotyper对茄病镰刀菌种复合体（Fusarium solani species complex，28.6%）和藤仓镰刀菌种复合体（Fusarium fujikuroi species complex，28.6%）的种/种复合体水平鉴定率在数值上高于EXS2600。两系统对暗色霉菌的鉴定性能均有限，且Bruker Biotyper数据库未收录Trichophyton indotineae。此外，与Biotyper相比，EXS2600提供了更简单的样本制备流程。结论：本研究结果凸显Zybio EXS2600 Ex-Accuspec数据库及系统作为丝状真菌常规鉴定中有前景且可靠的工具，具有较高的鉴定率和相对简单的样本制备流程。此外，降低有效性 cutoff 水平可能改善Zybio EXS2600系统的性能。
**研究背景与立题依据**
侵袭性丝状真菌感染，尤其是曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、毛霉属（Mucor）和足放线病菌属（Scedosporium）所致感染，因特异性诊断工具可及性有限而难以诊断，且这些真菌对现有抗真菌药物敏感性常降低，二者共同导致患者高病死率。每年有超过2,113,000人被诊断为侵袭性曲霉病，尤其在慢性阻塞性肺疾病、重症监护、肺癌及血液系统恶性肿瘤患者中，其粗年病死率达85.2%，约合1,801,000例死亡。皮肤癣菌病是由角蛋白溶解性丝状真菌所致的最常见全球性感染，主要涉及毛癣菌属（Trichophyton）和小孢子菌属（Microsporum）。新识别的物种如Trichophyton indotineae形态学上与须癣毛癣菌复合体（Trichophyton mentagrophytes complex）相似，常规形态学方法难以可靠区分，且因其高度抗真菌耐药性和全球广泛分布构成重大公共卫生威胁。目前丝状真菌鉴定的标准方法依赖表型检查（宏观与微观），但存在敏感性较低、周转时间长、需要经验丰富的专家以及标本侵入性等挑战；测序技术虽可用于检测隐蔽或不可培养的霉菌物种，但耗时且昂贵。MALDI-TOF MS已因快速、经济高效和高通量改变临床细菌学，其在丝状真菌中的应用近期有所增长，但有效性很大程度上取决于光谱数据库的质量和规模。目前全球最广泛使用的基于质谱的临床真菌学鉴定系统为MALDI Biotyper和VITEK MS，新近出现的类似原理设备包括Axima、MicroIDSys系统、Microtyper MS和Zybio EXS2600。不同MALDI-TOF MS系统性能差异显著，尤其鉴定丝状真菌时，因此有必要评估新系统和数据库。本研究旨在评估新型Zybio EXS2600 Ex-Accuspec数据库及系统与MALDI Biotyper Filamentous Fungi Library 3.0数据库及系统在霉菌常规临床鉴定中的性能，采用直接提取法，并以本研究参考鉴定结果评价鉴定结果。
**研究方法概述**
研究纳入180株经形态学充分表征的临床霉菌分离株，代表11个属23个种或种复合体，同时分析来自3个属8个种的8株参考菌株（购自ATCC，由土耳其公共卫生机构国家真菌学参考实验室提供）。采用EXS2600 EX-Accuspec V1.4.6.16和Biotyper MBT Filamentous Fungi Library 3.0，两系统均采用固体培养基提取法。结果以厂商推荐评分和降低的 cutoff 评分分别评价。关键技术方法包括：菌株初始鉴定采用宏观与微观形态学检查，并对18株选定临床分离株补充全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）以进一步明确分类学归属；WGS采用PromethION 2 Solo系统（Oxford Nanopore Technologies），测序读段采用Kraken2（PlusPF数据库）和Kaiju（nr_euk数据库）进行分类学归类，采用minimap2 v2.31比对至候选参考基因组，以核苷酸一致性和基因组覆盖度支持分类学判定；MALDI-TOF MS鉴定中，霉菌于沙氏葡萄糖琼脂（SDA）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上25 °C和30 °C大气条件下培养，依菌种不同在生长出现后1–7天提取（曲霉SC和毛霉目1–2天，镰刀菌SC 2天，皮肤癣菌7天），EXS2600采用其霉菌样本预处理试剂盒（甲酸和乙腈提取），Biotyper采用厂商推荐的洗涤和离心系列步骤；采用Zybio Ex-smart spec软件（版本1.1.1.1005）以基于相关性的距离度量和单链接层次聚类生成树状图；统计学采用双侧精确McNemar检验比较配对分类数据，采用偏差校正和加速（BCa）bootstrap法（50,000次重采样）计算95%置信区间。研究经?am and Sakura City Hospital伦理委员会批准（批准号146，2024年9月11日）。
**研究结果**
*EXS2600与Bruker Biotyper总体鉴定率比较*：在180株临床分离株中，采用厂商推荐评分阈值时，EXS2600在种/种复合体水平（57.2% vs. 17.2%；差值40.0个百分点，95% CI：30.0–49.4；p < 0.001）和属水平（82.8% vs. 45.6%；差值37.2个百分点，95% CI：27.8–46.1；p < 0.001）的正确鉴定率均显著高于Bruker Biotyper。采用降低评分阈值时，EXS2600在种/种复合体水平（82.8% vs. 45.6%；差值37.2个百分点，95% CI：27.8–46.1；p < 0.001）和属水平（91.7% vs. 66.7%；差值25.0个百分点，95% CI：17.2–32.8；p < 0.001）的正确鉴定率亦显著更高。统计比较采用双侧精确McNemar检验。
*全基因组测序对分类学归属的澄清*：对18株选定临床分离株进行WGS以进一步明确分类学鉴定，在部分分离株中观察到初始实验室鉴定与基于WGS的归属之间存在差异，尤其见于亲缘关系密切的真菌物种之间。
*各菌种鉴定性能*：EXS2600系统对烟曲霉（80.8%）、黄曲霉（93.8%）和皮肤癣菌（85.0%）达到较高的种水平鉴定率；相比之下，Bruker Biotyper对茄病镰刀菌种复合体（FSSC，28.6%）和藤仓镰刀菌种复合体（FFSC，28.6%）的种水平鉴定率在数值上更高。黑曲霉（Aspergillus niger）种水平正确鉴定率Biotyper为15.8%、EXS2600为52.6%。两系统对暗色霉菌鉴定性能均有限，且Bruker Biotyper数据库未收录T. indotineae。总体而言，在所评价条件下EXS2600对曲霉属（69.2%）和皮肤癣菌（85.0%）的种水平鉴定率更高。
*评分阈值对鉴定率的影响*：采用厂商推荐阈值（属≥1.7、种≥2.0）时，EXS2600正确鉴定属水平149株（82.8%）、种/种复合体水平103株（57.2%）；Biotyper分别为82株（45.6%）和31株（17.2%）。采用降低阈值（属≥1.5、种≥1.7）时，EXS2600正确鉴定属水平165株（91.7%）、种/种复合体水平149株（82.8%）；Biotyper分别为120株（66.7%）和82株（45.6%）。EXS2600有15株（8.3%）临床分离株评分低于置信阈值（<1.5），Biotyper有60株（33.3%）。
*皮肤癣菌鉴定*：在19株须癣毛癣菌复合体分离株中，EXS2600以≥2.0评分成功鉴定89.5%（17/19）至种复合体水平，而Biotyper仅15.8%（3/19）鉴定至种水平。6株红色毛癣菌复合体分离株中EXS2600鉴定3株，Biotyper未鉴定出任何种复合体水平。10株Trichophyton tonsurans临床分离株均被EXS2600鉴定，而Biotyper未鉴定出任何种水平。采用种水平阈值≥1.7时，EXS2600鉴定全部40株皮肤癣菌临床分离株（100%），Biotyper为42.5%（17/40）。
*镰刀菌属鉴定*：在PDA上25 °C培养48小时的镰刀菌分离株较同等条件下SDA培养者倾向于获得更高的MALDI-TOF MS鉴定评分（该观察提示培养基可能影响鉴定性能，但未定量评价光谱峰强度等光谱质量参数）。在所评价条件下Biotyper对FSSC和FFSC的鉴定率在数值上高于EXS2600：评分≥2.0时FSSC为28.6%、FFSC为26.7%；阈值降至≥1.7时Biotyper对FSSC达52.4%、FFSC达73.3%，而Zybio对FSSC为47.6%、FFSC为66.7%。
*暗色霉菌鉴定*：黑曲霉种水平鉴定成功率较低（Biotyper 15.8%，EXS2600 52.6%）。9株Alternaria alternata中4株、5株Curvularia species中1株经EXS2600成功鉴定，而Biotyper均未鉴定出；种水平阈值降至≥1.7时，EXS2600对A. alternata提高至8/9、对Curvularia species提高至3/5，且Cladosporium cladosporioides分离株亦在此标准下被鉴定。采用降低的种水平阈值≥1.7时，暗色霉菌中EXS2600正确鉴定12株（80%），Biotyper为4株（26.7%）。
*毛霉目鉴定*：评价了代表3个属3个种（Lichtheimia corymbifera、Rhizomucor pusillus和Rhizopus arrhizus）的8株毛霉目分离株，其中4株经EXS2600正确鉴定至种水平；相比之下Biotyper仅鉴定出R. arrhizus一个种。R. pusillus分离株经EXS2600获得1.35的鉴定评分，低于所评价阈值，但数据库归属与其形态学鉴定一致。采用降低评分阈值时，8株临床分离株中6株经EXS2600在属和种水平均获鉴定；Biotyper仅鉴定1株至种水平（R. arrhizus）、3株至属水平。
*树状图分析*：采用基于相关性的距离度量和单链接层次聚类生成树状图，每株分离株选取最高鉴定评分的光谱（包括评分<1.7者），每个终端分支代表一株分离株光谱，较短光谱距离表示较大光谱相似性，分支颜色由软件自动分配以便可视化。分别生成曲霉属、皮肤癣菌、镰刀菌属、暗色霉菌和毛霉目树状图，作为光谱相似性的补充描述性分析，未纳入两系统鉴定性能的主要统计学比较。
**讨论与结论**
早期启动抗真菌治疗对真菌感染的有效治疗至关重要，快速准确鉴定特定病原体有助于避免基于显微镜检查或培养阳性结果的经验性无效或昂贵治疗。霉菌物种鉴定已从传统表型显微镜检查演进至更复杂昂贵的DNA测序和杂交技术，现今日益由应用生物物理和生物信息学技术的MALDI-TOF MS主导，但因其商业参考库不足和制备方法差异，在临床霉菌鉴定中的应用仍有限。本研究主要目的是评估新型Zybio EXS2600 Ex-Accuspec V1.4.6.16数据库及系统鉴定早期临床霉菌病原体的性能，并与现有Bruker Filamentous Fungi Library 3.0数据库及系统比较；两数据库均涵盖广泛的丝状真菌，但在所评价实验条件下EXS2600鉴定率高于Bruker Biotyper，提示EXS2600可能作为丝状真菌常规临床鉴定的有用工具，但仍需进一步验证。研究中EXS2600对临床霉菌分离株尤其曲霉属（69.2%）、烟曲霉（80.8%）、黄曲霉（93.8%）和皮肤癣菌（85.0%）的种/种复合体水平鉴定率更高，两系统对暗色霉菌鉴定评分均低，且Biotyper未能鉴定T. indotineae。皮肤癣菌（n = 40）种/种复合体水平鉴定率EXS2600显著更高（85% vs. 10%）；Biotyper对毛癣菌属鉴定率显著偏低（红色毛癣菌复合体和T. tonsurans均为0%，须癣毛癣菌复合体仅15.8%），而EXS2600在阈值2.0时对毛癣菌属鉴定率为50.0%–100%，阈值降至≥1.7时提高至100%，Biotyper相应为10.0%–52.6%（限于其数据库收录物种）。上述发现与Tsai等报道一致。毛癣菌属准确鉴定对流行病学研究和有效治疗策略均至关重要；T. indotineae为新兴皮肤癣菌，常与特比萘芬耐药相关且形态学上难以与须癣毛癣菌复合体成员区分。本研究中单株分离株经EXS2600推定鉴定为T. indotineae，并经土耳其国家真菌学参考实验室形态学检查和抗真菌药敏试验支持，采用CLSI M38肉汤微量稀释法测得特比萘芬MIC为16 μg/mL，但未进行分子确认，故其鉴定应视为推定，且基于单株分离株的发现不能就物种特异性鉴定性能得出可靠结论。播散性镰刀菌病和慢性浅表性镰刀菌病因其治疗耐药和侵袭性临床进展，亟需更有效的诊断和治疗策略。解释本研究结果时需注意种水平与种复合体水平鉴定的区别：鉴定至种复合体水平并不必然确定复合体内单个物种的身份，尤其当亲缘关系密切的物种具有不同临床特征时；然而此类鉴定仍可为患者管理提供临床有用信息。尽管分子方法可提供有价值的额外分类学信息，但对亲缘关系密切的真菌而言，明确的种水平区分可能仍然困难，且因成本和周转时间考虑，在常规诊断实验室中对每株临床分离株进行全面测序并不总是可行，因此鉴定结果应按现有证据支持的分类学分辨率解释；整合形态学发现、MALDI-TOF MS结果及必要时分子方法和临床适当时抗真菌药敏试验的实用诊断策略，可在认识各鉴定方法局限性的同时支持临床决策。黑化真菌在形态学和MALDI-TOF MS分析中均难以鉴定，因其倾向于产生仅含少量低丰度峰的弱指纹质谱；既往研究表明源自深色色素区域的MALDI质谱产生弱甚至无离子信号，提示黑化真菌中的深色色素可能阻碍MALDI-TOF MS过程中的解吸和电离，且黑化真菌在商业数据库中常代表性不足，改善其收录可能提高鉴定准确性。除快速鉴定能力外，MALDI-TOF MS可区分常见霉菌物种如曲霉属、镰刀菌属、皮肤癣菌和毛霉目，亦可鉴定罕见真菌包括Paecilomyces spp.。使用MALDI-TOF MS成功鉴定霉菌取决于数据库、所用系统、提取方法和菌落年龄等因素；Bruker Biotyper使用单独的MBT Filamentous Fungi Library 3.0鉴定丝状真菌，而EXS2600 EX-Accuspec V1.4.6.16数据库在单一数据库系统中包含细菌、酵母和丝状真菌参考光谱。真菌鉴定使用MALDI-TOF MS系统的一个重要局限是参考数据库的物种覆盖度；本研究中Biotyper数据库未收录温度双相真菌，而双相真菌因气候变化和全球旅行日益在其流行区外被检出，将其纳入MALDI-TOF数据库对非流行国家的准确诊断至关重要；此外Biotyper Filamentous Fungi Library 3.0在属和种水平对皮肤癣菌病原体的代表性非常有限，且未收录新识别的耐药物种T. indotineae。当单一群体内不同物种显示不同药敏模式（如曲霉属），或如Talaromyces物种那样必须区分致病与非致病物种时，鉴定方法应能利用参考数据库将分离株鉴定至种水平；此外数据库必须持续更新以跟上快速演变真菌命名法。考虑使用MALDI-TOF MS进行霉菌鉴定的临床实验室应评估本地流行病学以设定现实性能预期，持续更新霉菌数据库可增强对种内变异性的捕获并改善诊断性能。研究显示EXS2600在种或种复合体水平获得更高鉴定率，尤其对常见曲霉SC（69.2%）和皮肤癣菌（85%），此能力可能通过提供与抗真菌治疗相关的更详细分类学信息支持临床决策。不同生长条件和提取方法用于获取真菌蛋白进行MALDI-TOF MS鉴定；固体培养基在常规临床真菌学实验室中常用，因其可同时评估分离株的宏观和微观形态特征；本研究采用固体培养基提取法制备所有样本，两系统均使用来自同一培养平板和可比菌落区域的真菌材料以确保采样条件一致，然而样本制备差异可能影响Bruker Biotyper系统的鉴定性能，因此观察到的两平台差异应在所评价的固体培养基工作流程背景下解释，而非作为各自优化条件下最大可达分析性能的证据。实验室实施有效生物安全措施至关重要，霉菌鉴定涉及的所有程序从样本处理至MALDI-TOF MS提取均应采取适当生物安全预防措施，包括适当时使用II级生物安全柜，以防止霉菌孢子污染并保护人员免于意外暴露。除更简单的样本制备流程外，EXS2600系统在种和属水平的正确鉴定率均高于Bruker Biotyper，提示其在常规实验室工作流程中的潜在优势，因为无法可靠鉴定的分离株可能需要重复提取、额外检测或替代鉴定方法，可能增加工作量并延迟最终鉴定；然而由于未系统评价周转时间和重复检测频率，需进一步研究确定这些优势是否能转化为临床实践中可测量的时间节省。临床和实验室标准协会（CLSI）已发布指南文件协助临床实验室采用和验证商业MALDI-TOF MS系统，该方法已被验证用于细菌和酵母菌种的快速准确鉴定，其通过完整细胞的独特指纹确定微生物培养物结构蛋白的分子量而无需预选或纯化步骤，但因霉菌物种的特性仍需额外验证；本研究中两系统性能亦采用来自公认培养物保藏中心的特征明确参考菌株按相关CLSI指南和厂商建议进行评价，鉴定结果按与预期种水平鉴定的一致性评价，参考菌株被正确鉴定时认为系统可接受。既往多项研究致力于优化涉及不同生长条件和提取方法的现有方案；Cassagne等将相关真菌在SDA平板上培养72小时，比较涉及甲酸（FA）提取、离心和微珠机械裂解的不同样本制备程序，结果提示这些方法所得光谱无显著差异，表明可采用更简单的提取技术以节省时间和资源；Coulibaly等对Pseudallescheria–Scedosporium种复合体的研究采用麦芽琼脂上菌丝的三氟乙酸提取和SDA上菌丝的FA提取，两法鉴定准确性无显著差异，但研究提示较长孵育期可能带来更好的鉴定结果；本研究中依霉菌物种不同，在25 °C和30 °C大气条件下于SDA和PDA上培养1–7天后经FA提取获得成功的MALDI-TOF MS鉴定结果。采用厂商推荐评分阈值时，EXS2600属水平正确鉴定率为82.8%（149/180）、种/种复合体水平为57.2%（103/180），Bruker Biotyper分别为45.6%（82/180）和17.2%（31/180）；采用降低阈值（属≥1.5、种/种复合体≥1.7）时，EXS2600相应鉴定率提高至91.7%（165/180）和82.8%（149/180），Bruker Biotyper为66.7%（120/180）和45.6%（82/180）。既往研究表明将种水平鉴定阈值从≥2.0降至≥1.7可提高鉴定率，尤其Karab??ak等报道使用降低阈值配合原始和补充Bruker光谱库可改善皮肤癣菌鉴定率。尽管本研究采用的参考鉴定方法未检测到错误鉴定，但这些发现应谨慎解释：分子确认仅限于18株选定临床分离株，降低评分阈值的可靠性未在整个分离株集合中独立验证，因此在推荐降低阈值用于常规临床实践前需采用全面分子参考方法进一步研究。本研究中EXS2600系统有15株临床分离株（8.3%）鉴定评分低于1.5，Biotyper系统有60株（33%）低于该阈值，而这些结果与形态学鉴定一致。近期中国厦门和Zybio EXS2600 MALDI-TOF MS系统已引入欧洲，既往比较研究已评价这些系统相对Bruker Biotyper对丝状真菌的鉴定性能；本研究中在所评价实验条件下EXS2600鉴定率高于Bruker Biotyper，尤其对曲霉属和皮肤癣菌，这些发现应按参考鉴定支持的分类学分辨率在种或种复合体水平解释。本研究的关键优势之一是在同一实验室内直接配对比较MALDI-TOF MS仪器系统，且检查了180株临床霉菌分离株和8株参考菌株以更好反映临床实验室性能；研究在典型临床实验室条件和工作流程下评价性能，未检测常规方法通常鉴定的过熟菌落，而是评估初始生长出现后较短时间范围内（依物种1–7天：曲霉SC和毛霉目1–2天，镰刀菌SC 2天，皮肤癣菌7天）观察到的生长，此物种特异性鉴定时间线与其它报道相似。本研究局限之一为单中心开展，与多中心研究相比限制结果普适性；此外鉴定率可能因所选用于检测的特定菌落霉菌团块、技术人员专业水平和所用仪器或数据库更新等因素而变化；某些临床相关物种包括T. indotineae、Aspergillus japonicus、Aspergillus alabamensis和Talaromyces stollii仅由单株分离株代表，此有限代表性妨碍物种特异性鉴定准确性的可靠评估且不能反映潜在种内光谱变异性，因此这些物种的鉴定结果应视为初步观察而非平台性能的确切证据，需更大数量独立临床分离株的进一步研究验证两MALDI-TOF MS系统对这些物种的鉴定准确性；另一局限为潜在验证偏倚，因分子确认仅限于18株选定临床分离株，未行分子确认的分离株中可能的鉴定错误不能完全排除，可能影响两系统鉴定性能的估计，未来纳入所有分离株独立分子确认的研究将提供种水平鉴定准确性更稳健的评估。MALDI-TOF MS较传统鉴定方法具有显著优势，尤其对罕见和表型相似物种的识别；本研究中将种水平鉴定阈值从≥2.0降至≥1.7使EXS2600鉴定率从57.2%提高至82.8%、Bruker Biotyper从17.2%提高至45.6%，但这些改善应谨慎解释，因为降低阈值未采用分子参考方法对整个分离株集合独立验证。总之，在所评价的固体培养基工作流程条件下，EXS2600鉴定率高于Bruker Biotyper系统；在厂商推荐阈值≥2.0时，EXS2600种/种复合体水平鉴定率达57.2%（103/180），而Bruker Biotyper为17.2%（31/180），表明在所评价条件下鉴定性能显著更高，尽管仍需进一步改善；其相对简单的样本制备流程和改善的鉴定性能可能在常规实验室工作流程中提供实际优势；然而解释这些发现时应考虑有限的分子验证和种复合体水平鉴定的纳入，需纳入全面分子验证的进一步研究以确立这些结果的诊断准确性和普适性。
