《Metabolites》：Effect of Carvacrol on PI3K/Akt Signaling, GLUT2 and Insulin Expression in Pancreatic Tissue in a Streptozotocin-Induced Type 1 Diabetic Rat Model
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背景/目的：糖尿病（DM）是全球日益严重的重大健康问题，患病率不断上升。尽管香芹酚（CRV）的抗糖尿病作用已有报道，但其在胰腺组织中作用的具体分子机制尚不清楚。本研究探讨了在链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（T1DM）大鼠模型中，胰腺组织内磷脂酰肌醇3-激
背景/目的：糖尿病（DM）是全球日益严重的重大健康问题，患病率不断上升。尽管香芹酚（CRV）的抗糖尿病作用已有报道，但其在胰腺组织中作用的具体分子机制尚不清楚。本研究探讨了在链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（T1DM）大鼠模型中，胰腺组织内磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路与葡萄糖转运体2（GLUT2）及胰岛素表达之间的关系。方法：将40只雄性Wistar白化大鼠随机分为5组：假手术组（Sham）、CRV组、链脲佐菌素（STZ）组、STZ+CRV 40组和STZ+CRV 20组。实验开始时，对糖尿病组大鼠腹腔注射55 mg/kg STZ。按所示剂量给予CRV共六周。每周监测血糖水平。采用免疫组织化学和Western blot分析评估胰腺组织中PI3K、磷酸化Akt（pAkt）和GLUT2的表达水平，胰岛素表达仅通过免疫组织化学评估。结果：与STZ组相比，20 mg/kg香芹酚治疗从第10天起与显著降低的血糖水平相关，而STZ+CRV 40组与STZ组在诱导后测量期间未观察到显著差异。免疫组织化学和Western blot分析表明，糖尿病组中降低的PI3K、pAkt和GLUT2蛋白表达水平在给予20 mg/kg香芹酚后显著升高。免疫组织化学分析还显示该组胰岛素表达增加。结论：这些发现提示香芹酚治疗可能对血糖控制产生有益作用，并伴随胰腺组织中PI3K/Akt磷酸化相关信号的改变以及GLUT2和胰岛素免疫反应性的增加。
糖尿病（DM）已成为全球重大公共卫生问题，全球超过5亿人患病，是21世纪增长最快的全球卫生紧急事件之一。据估计，全球20~79岁成年人中有5.89亿患有糖尿病，约占成年人口的11.1%。根据美国糖尿病协会《糖尿病医疗护理标准（2022）》，DM主要分为四个亚组：1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、妊娠期糖尿病以及由外分泌胰腺疾病、青少年的成人起病型糖尿病（MODY）、药物和化学物质等不同原因诱发的DM。胰岛β细胞占胰岛细胞的60%~70%，多位于中央区域，负责分泌胰岛素。在T1DM中，进行性β细胞丧失和功能障碍促发临床症状，尽管诊断时β细胞丧失程度因个体和年龄组而异。部分T1DM患者仍持续产生少量胰岛素，提示β细胞功能可能在一定程度上得以保留。链脲佐菌素（STZ）是从不产色链霉菌中分离的亚硝基脲类似物，常用于动物实验诱导糖尿病，可造成β细胞损伤。单次高剂量STZ可导致广泛的胰腺β细胞损伤，引起胰岛素缺乏性糖尿病。STZ具有亲水性，通过葡萄糖转运体2（GLUT2）进入细胞，而GLUT2在β细胞膜上高表达，因此肝脏、肾脏和肠道等其他表达GLUT2的器官也受STZ影响。香芹酚（CRV）是百里香、牛至和胡椒草等植物精油中的单萜类成分。既往研究已考察了香芹酚的代谢和潜在毒性。CRV可调节多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤活性及TRPM7离子通道抑制作用。香芹酚是一种强效单萜酚，对抑制体内活性氧（ROS）至关重要。富含香芹酚的精油具有高抗氧化活性，并能增强内源性抗氧化剂的效力。据报道，大鼠口服灌胃香芹酚的LD50为810 mg/kg。近年研究表明，香芹酚的抗糖尿病作用可能通过不同组织中的多种分子机制实现。例如，CRV已被证明可通过激活血管组织中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路改善糖尿病诱导的主动脉高收缩性。近期一项研究表明，长期给予香芹酚可通过提高STZ诱导糖尿病小鼠的肝脏酶活性来增强葡萄糖耐量并降低血糖水平，但该研究中香芹酚经腹腔注射给药，而本研究采用口服灌胃。同样，在2型糖尿病模型中，有报道称CRV通过调节GPR41/43信号通路显著降低血糖水平。PI3K在细胞发育、分化、凋亡、葡萄糖转运、代谢、细胞存活、癌症进展和炎症等细胞过程中具有重要作用。活化的PI3K磷酸化细胞内膜上的底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3），是招募包括Akt（丝氨酸-苏氨酸激酶）在内的其他信号蛋白的启动因子。在下调过程中，Akt磷酸化FOXO1（叉头盒O-1）并抑制其活性。磷酸化的FOXO1通过增加胰腺β细胞中胰腺和十二指肠同源盒-1（PDX-1）的表达来加速胰岛素转录。PDX-1增强成熟β细胞中胰岛素和GLUT2的激活。PDX-1也是维持β细胞表型和分化所必需的。胰岛素通过PI3K/Akt通路调节β细胞功能和胰岛素分泌，随着该通路的激活，β细胞胰岛素分泌量增加。如果PI3K/Akt胰岛素信号通路出现障碍，朗格汉斯胰岛中的β细胞将发生功能丧失和胰岛素抵抗。葡萄糖转运体（GLUTs）使葡萄糖依赖浓度通过质膜而不消耗ATP。葡萄糖通过GLUT2的易化扩散进入胰腺β细胞。GLUT2是胰腺β细胞中表达的主要葡萄糖转运体之一，在葡萄糖感知和葡萄糖转运中发挥重要作用。GLUT2大量存在于肝脏、肾脏、肠道和胰岛组织中。GLUT2是胰腺β细胞葡萄糖稳态所必需的。作为β细胞中的葡萄糖转运体，GLUT2在高血糖条件下通过增加细胞葡萄糖摄取来刺激胰岛素释放。触发胰岛素释放的葡萄糖通过GLUT2转运进入胰腺β细胞。本研究旨在探讨香芹酚在1型糖尿病模型中对胰腺β细胞的降血糖和修复作用，以及该作用是否通过PI3K/Akt通路实现。因此，本研究采用免疫组织化学和Western blot分析，探讨香芹酚治疗后胰腺组织中PI3K/Akt磷酸化特异性信号的变化及其与GLUT2和胰岛素表达的关联。
研究人员开展了动物实验研究。研究使用40只2~3月龄雄性Wistar大鼠，随机分为5组：Sham组（n=5，橄榄油作为溶剂）、CRV组（n=5，40 mg/kg CRV）、STZ组（n=10，55 mg/kg STZ）、STZ+CRV 40组（n=10，55 mg/kg STZ+40 mg/kg CRV）和STZ+CRV 20组（n=10，55 mg/kg STZ+20 mg/kg CRV）。实验第1天，STZ、STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组经腹腔单次注射55 mg/kg STZ。72小时后，血糖>250 mg/dL者视为糖尿病并纳入研究。此后CRV组、STZ+CRV 40组和STZ+CRV 20组以指定剂量经口灌胃给予溶于橄榄油的香芹酚，持续42天。每周同一时间经尾静脉采血使用血糖仪测定血糖。实验结束时以氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉后颈椎脱臼处死，切除胰腺组织。采用抗磷酸化PI3K p85α（Tyr607）、抗磷酸化Akt1（Ser473）和抗GLUT2抗体进行免疫组织化学和Western blot分析，抗胰岛素抗体仅用于免疫组织化学分析。研究结论为：20 mg/kg香芹酚治疗显著降低链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠的血糖水平，并增加胰腺组织中PI3K、pAkt、GLUT2和胰岛素表达；这些发现提示香芹酚的抗糖尿病作用可能与调节PI3K/Akt信号通路有关，该通路可能促进GLUT2和胰岛素表达的增加；尽管20 mg/kg剂量在某些评估参数上显示出更明显效果，但仅研究两个剂量无法就剂量-反应关系得出明确结论；需要进一步的实验和临床研究来阐明其潜在机制和临床意义。
本研究用到的主要关键技术方法包括：免疫组织化学（IHC）法检测胰腺组织中胰岛素、PI3K、pAkt和GLUT2的蛋白表达与定位，并进行半定量评分；Western blot法检测胰腺组织中磷酸化PI3K p85α（Tyr607）、磷酸化Akt1（Ser473）和GLUT2的蛋白表达水平，以β-actin为内参；采用血糖仪每周监测尾静脉血糖；以苏木精-伊红染色相关组织学处理进行形态学观察。样本队列来源为Duzce大学动物实验中心饲养的40只雄性Wistar大鼠。
研究结果如下：
3.1 血糖水平：实验结束时，STZ组与Sham、CRV和STZ+CRV 20组之间血糖水平差异有统计学意义（p<0.05）；Sham与CRV组间无显著差异（p=0.450）。实验第10天起，STZ组与STZ+CRV 20组之间出现统计学显著差异并持续至实验结束（p<0.05）。6周末，STZ组与STZ+CRV 40组之间未检测到统计学显著差异（p=0.690）。Sham和CRV组与STZ+CRV 40组之间从第3天至实验结束维持统计学显著差异（p<0.05）。第17天和第31天，STZ+CRV 20组与Sham和CRV组之间未观察到统计学显著差异。实验第17、24、31和45天，STZ+CRV 40组与STZ+CRV 20组之间检测到统计学显著差异（p<0.05）。所有组体重在实验期间均增加。
3.2 免疫组织化学评估：抗胰岛素、抗PI3K、抗pAkt和抗GLUT2抗体显示细胞质免疫定位，免疫阳性染色主要见于胰岛内细胞，胰岛及外分泌部结构完整。PI3K：Sham与CRV组间无显著差异（p=0.513）；STZ组表达显著降低（p<0.05）；STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组较STZ组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 20组PI3K表达显著高于STZ+CRV 40组（p<0.05）。pAkt：Sham与CRV组表达相似（p=0.352）；STZ组显著降低，STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 20组显著高于STZ+CRV 40组（p<0.05）；STZ+CRV 20组与Sham和CRV组间差异有统计学意义（p<0.05）。GLUT2：Sham与CRV组间无统计学差异（p=0.375）；STZ组显著降低，与其他4组比较差异有统计学意义（p<0.05）；STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 20组GLUT2表达显著高于STZ+CRV 40组（p<0.05）；STZ+CRV 20组与Sham和CRV组间差异有统计学意义（p<0.05）。胰岛素：Sham与CRV组表达强烈且组间无差异（p=0.107）；STZ组β细胞胰岛素表达弱，较Sham和CRV组显著降低（p<0.05）；STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组较STZ组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 20组显著高于STZ+CRV 40组（p<0.05）。
3.3 Western blot检测：PI3K：Sham和CRV组表达高，STZ组和STZ+CRV 40组显著降低（p<0.05）；STZ+CRV 20组较STZ和STZ+CRV 40组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 20组与Sham和CRV组表达相似（p=0.227，p=0.097）；STZ与STZ+CRV 40组间无显著性（p=0.791）。pAkt：Sham与CRV组表达相似（p=0.549）；STZ组较其他组显著降低（p<0.05）；STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组较STZ组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 20组升高幅度大于STZ+CRV 40组且差异有统计学意义（p<0.05）；STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组较Sham和CRV组显著降低（p<0.05）。GLUT2：Sham与CRV组间无显著差异（p=0.724）；STZ组较Sham和CRV组显著降低（p<0.05）；STZ+CRV 40和STZ+CRV 20组较STZ组显著升高（p<0.05）；STZ+CRV 40与STZ+CRV 20组间无统计学显著性（p=0.777）。总体而言，STZ组PI3K、pAkt和GLUT2蛋白表达较Sham和CRV组显著降低，STZ+CRV 20组较STZ组显著升高（p<0.05）。
讨论部分总结：糖尿病是重大公共卫生问题，全球超过5亿人患病。氧化应激是糖尿病及其并发症的主要原因，通过过量ROS产生抑制胰岛素转录基因从而减少胰岛素分泌，并引起β细胞凋亡。香芹酚存在于牛至和百里香中，因其抗氧化和抗炎作用被报道可预防糖尿病。既往研究强调Akt信号和GLUT2参与胰腺β细胞葡萄糖代谢和胰岛素分泌。CRV已被证明可降低T1DM血糖，但机制尚未阐明。Bayramoglu等此前研究了香芹酚在STZ诱导糖尿病大鼠中的作用，而本研究专门探讨胰腺组织中PI3K/Akt信号与GLUT2及胰岛素表达的关联。研究观察到免疫组织化学分析中GLUT2表达相应增加，β细胞关键葡萄糖转运体GLUT2表达的增加可能是胰岛素表达增加的促进因素之一。基于研究结果，提示香芹酚可能通过调节糖尿病胰腺中PI3K/Akt通路上调GLUT2和胰岛素表达，从而帮助降低血糖水平。本研究在T1DM大鼠模型中以20 mg/kg CRV给药6周观察到血糖水平统计学显著降低，第17、24、31和45天20 mg/kg组血糖显著低于40 mg/kg组（p<0.05）。T1DM中胰岛素缺乏突出，本研究中STZ组胰岛胰岛素表达最低，STZ+CRV 20和STZ+CRV 40组胰腺β细胞胰岛素表达显著增加，提示CRV可能增强胰腺β细胞胰岛素表达，这可能有助于20 mg/kg CRV给药的降血糖效应。尽管T1DM以胰腺β细胞丧失为特征，当前治疗主要依赖胰岛素治疗维持血糖控制；除常规治疗外，新兴治疗策略旨在通过靶向PI3K/Akt等通路保护β细胞存活和功能。动物实验表明，T1DM等年轻时发生的糖尿病中β细胞更新概率较高；在TIF-IAΔ/Δ小鼠模型中，进行性β细胞丧失后主要通过存活β细胞增殖实现再生。PI3K/Akt信号通路在胰岛素信号中发挥重要作用，调节血糖摄取、细胞增殖和糖原合成；上调PI3K/Akt信号可促进β细胞增殖和存活，并可逆转自身免疫诱导的β细胞破坏。虽然T1DM以β细胞破坏为特征，但本研究中香芹酚治疗后观察到的胰岛素免疫染色强度增加值得注意，因此CRV可能有助于保护T1DM中的β细胞功能。葡萄糖刺激的胰岛素分泌是正常代谢稳态的核心，该过程由葡萄糖通过GLUT2进入β细胞所激发；GLUT2作为葡萄糖转运体充当第一信使，触发β细胞葡萄糖摄取。2019年一项研究指出香芹酚改善T1DM和T2DM的心脏改变，该改善归因于通过PI3K/Akt信号通路增加GLUT4从而提高心肌细胞葡萄糖摄取。本研究也探讨了香芹酚对T1DM中PI3K/Akt通路和GLUT2的影响，发现作为胰腺β细胞葡萄糖转运体的GLUT2表达与β细胞胰岛素表达一同增加，提示香芹酚治疗、PI3K/Akt信号与GLUT2及胰岛素表达增加之间可能存在关联。另一项研究明确显示10和20 mg/kg CRV治疗改善糖尿病小鼠高血糖，香芹酚在10和20 mg/kg剂量下显著降低血糖，但剂量间无显著差异；在糖尿病小鼠中，被高血糖抑制的PI3K/Akt信号通路被香芹酚重新激活并防止主动脉高收缩性，与本研究一致，表明CRV在糖尿病中通过刺激PI3K/Akt通路发挥作用。另一项研究探讨CRV抗氧化特性对T1DM糖尿病诱导睾丸生殖损伤的影响，与糖尿病组相比，给予75 mg/kg香芹酚的糖尿病组在第8周检测到血糖显著降低，该研究使用高剂量香芹酚可能使抗糖尿病效应出现较晚；本研究中40 mg/kg较20 mg/kg降血糖幅度更小，20 mg/kg CRV的降血糖效应更明显，从第10天起与STZ组有统计学显著差异；然而仅评估两个剂量无法得出香芹酚抗糖尿病效应随剂量增加而减弱的结论，两剂量间的差异可能反映非线性剂量-反应关系，包括可能的毒物兴奋效应或其他剂量相关生物学因素，需要评估更广泛剂量范围（包括低于20 mg/kg）的研究来阐明。香芹酚也因其抗糖尿病作用被纳入T2DM研究：一项研究中10 mg/kg CRV给药6周，观察到空腹血糖统计学显著降低，组织学检查显示糖尿病相关肝肾损伤减轻；2024年一项T2DM大鼠模型研究得出结论香芹酚改善血糖和血脂水平，在10、20和40 mg/kg香芹酚给药组中，20 mg/kg降糖最显著，CRV给药35天后HbA1c水平也显著降低，表明长期血糖控制改善，该研究同样发现CRV在DM中最有效剂量为20 mg/kg，与本研究中两剂量间观察到的差异一致。与本研究结果不同，一项研究得出结论在T1DM中以25和50 mg/kg剂量给予香芹酚7天，与糖尿病组相比血糖仅轻微降低且无显著差异，据报道CRV对胰腺无负面影响但也未产生预期效果，该结果的原因可能是实验持续时间短。香芹酚治疗与糖尿病大鼠磷酸化特异性PI3K和Akt信号增加及血糖水平降低相关，这些变化伴随免疫组织化学和Western blot分析显示的GLUT2表达增加以及免疫组织化学显示的胰岛素表达增加；香芹酚治疗观察到的胰岛素表达增加可能有助于本研究中观察到的血糖水平降低；香芹酚在糖尿病中显示降低血糖水平，尤其是20 mg/kg香芹酚降血糖作用统计学显著；研究结果提示20 mg/kg香芹酚观察到的降血糖效应可能与胰腺组织中PI3K/Akt磷酸化特异性信号的改变以及GLUT2和胰岛素表达增加有关。本研究局限性包括：由于本论文项目的技术和机构限制，未评估血清胰岛素、血脂谱和C肽水平等额外代谢和临床参数；橄榄油用作香芹酚给药的溶剂，尽管橄榄油被报道具有潜在代谢效应，但相关实验组应用了相同的溶剂条件；由于使用针对PI3K p85α和AKT1的磷酸化特异性抗体而未独立评估总蛋白水平，观察到的变化应解释为磷酸化特异性信号的变化而非总蛋白丰度或通路激活的确切证据；样本量基于既往实验经验和已发表的STZ诱导糖尿病动物模型研究确定，未进行正式的先验功效分析；Western blot分析样本量相对较小，主要由于经费和试剂可获得性限制，这是本研究的另一局限性。本研究通过检测STZ诱导T1DM大鼠模型胰腺组织中磷酸化PI3K、磷酸化Akt、GLUT2和胰岛素表达的变化，对既往香芹酚抗糖尿病作用的研究有所贡献。
研究结论部分翻译：20 mg/kg香芹酚治疗显著降低链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠的血糖水平，并增加胰腺组织中PI3K、pAkt、GLUT2和胰岛素表达。这些发现提示香芹酚的抗糖尿病作用可能与调节PI3K/Akt信号通路有关，该通路可能促进GLUT2和胰岛素表达的增加。尽管20 mg/kg剂量在某些评估参数上显示出更明显效果，但仅研究两个剂量无法就剂量-反应关系得出明确结论。需要进一步的实验和临床研究来阐明其潜在机制和这些发现的潜在临床意义。
