匍匐剪股颖中AsMYB44对耐荫性的正向调控作用

《Agriculture》：The Positive Regulation of AsMYB44 on Shade Tolerance in Creeping Bentgrass

　　

荫蔽胁迫是限制植物生长发育的主要非生物因素，其影响主要通过光合途径发挥，在生长于大树和建筑物遮荫下的草坪草中尤为明显。MYB转录因子在植物光合作用中起关键作用，多个MYB成员参与植物荫蔽响应，但MYB44在植物荫蔽响应中的功能尚未见报道。本研究中，荫蔽胁迫下匍匐剪股颖（Agrostis stolonifera）中AsMYB44的过表达提高了植株的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量、净光合速率及抗氧化酶活性。转录组分析显示，AsMYB44过表达显著上调了与光合作用、光合作用天线蛋白及叶绿素代谢途径相关基因的表达。综上，这些结果表明过表达AsMYB44改善了匍匐剪股颖的耐荫性。研究结果提供了耐荫育种的重要候选基因。

研究背景方面，光是植物光合作用的能量来源，也是植物生长和代谢的基础。荫蔽作为一种普遍存在的非生物胁迫，显著影响植物的生长、发育及生理代谢过程。在城市绿地、林下区域和高尔夫球场等环境中，草坪草常遭受不同程度的荫蔽胁迫；美国荫蔽下的草坪占草坪总面积的25%，中国这一比例约为50%，因此荫蔽胁迫是草坪业的核心问题之一，培育耐荫草坪草品种对有效解决该问题至关重要。植物通过调整光能捕获及生理生化过程适应荫蔽胁迫，荫蔽下植株通常叶宽减小、分蘖减少；叶绿素在光能吸收、传递和转化中起关键作用，植物耐荫性与叶绿素a/b比值显著负相关；荫蔽导致光合有效辐射（PAR）和温度下降，进而影响光合速率，如随着荫蔽强度增加，狗牙根（Cynodon dactylon）叶片气孔导度和净光合速率显著下降，中度和重度荫蔽下草地早熟禾（Poa pratensis）叶片Fv/Fm值明显降低，表明荫蔽胁迫损害了PSII光化学活性；荫蔽胁迫通过诱导活性氧（ROS）积累触发抗氧化防御系统响应，影响过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性，并导致丙二醛（MDA）、过氧化氢（H₂O₂）和电解质渗漏（EL）水平变化。MYB类转录因子以保守的MYB结构域为特征，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中鉴定的196个MYB类转录因子中126个属R2R3-MYB家族；近年研究表明MYB转录因子在荫蔽信号通路中发挥重要作用，如荫蔽下AtMYB30转录水平显著下调并与光敏色素B（PHYB）及光敏色素互作因子（PIFs）互作，茶树（Camellia sinensis）中CsMYB7和CsMYB4显著上调并作为抑制因子抑制黄酮醇生物合成，白菜（Brassica rapa）中BrMYB29表达显著降低，葡萄（Vitis vinifera）中VvMYB12显著下调导致其靶基因黄酮醇合酶4（VvFLS4）下调进而减少果实黄酮醇积累。MYB44属R2R3-MYB转录因子家族，在生物胁迫、非生物胁迫和代谢调控中发挥重要作用，已有研究鉴定其参与耐旱性、耐盐性、冷胁迫和叶片衰老调控，但其在植物荫蔽响应中的确切作用尚待阐明，目前对该方面的认识有限。匍匐剪股颖是冷季型草坪草，具有生长快、叶片纤细、再生能力强和耐低修剪等优点。本研究旨在探究过表达AsMYB44能否增强匍匐剪股颖的耐荫性，为草坪草和作物的耐荫育种提供科学依据和重要候选基因资源。

研究方法上，研究人员以野生型（WT）匍匐剪股颖（品种'Penn-A4'）及两个独立的AsMYB44过表达转基因株系（OE1和OE2）为材料，设置荫蔽（PAR 120 μmol/m²/s）和正常光照（PAR 650 μmol/m²/s）两个处理，每处理3个生物学重复，处理70 d后测定形态指标、光合色素含量、光合性能和酶活性；主要关键技术方法包括：生物信息学分析（BLASTP检索同源蛋白、MEGA 7.0构建最大似然系统发育树）、农杆菌介导的遗传转化（以成熟种子诱导愈伤组织，经EHA105侵染获得过表达株系）、亚细胞定位（35S::AsMYB44-GFP在烟草中瞬时表达并结合DAPI染色共聚焦观察）、转录自激活与转录抑制活性分析（酵母双杂交及双荧光素酶报告检测）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）组织特异性与荫蔽响应表达分析、生理生化指标测定（EL、光合色素、气体交换、抗氧化酶活性及MDA含量）以及转录组测序与差异表达基因（DEGs）富集分析（Illumina测序，Trinity组装，Salmon定量，edgeR分析，KEGG和GO富集）。

研究结果方面，3.1 系统发育分析与亚细胞定位：匍匐剪股颖AsMYB44与Lolium rigidum的LrMYB44、Perennial ryegrass的LpMYB44和Lolium multiflorum的LmMYB44亲缘关系密切，AsMYB44与多年生黑麦草、Triticum dicoccoides、Triticum urartu和大麦的MYB44蛋白均含保守R2R3-MYB结构域；AsMYB44-GFP荧光与DAPI荧光在细胞核内重叠，表明AsMYB44蛋白定位于细胞核。3.2 AsMYB44在植物细胞中作为转录抑制因子：BD与BD-AsMYB44酵母细胞在SD/TRP培养基上正常生长但在SD/HIS/TRP培养基上不生长，表明AsMYB44在酵母系统中不具转录活性；烟草中AsMYB44-GAL4DB组荧光强度显著低于GAL4-LUC组，表明AsMYB44在烟草细胞中具转录抑制活性。3.3 组织特异性表达、荫蔽响应与遗传转化鉴定：AsMYB44在叶片中表达最高、根次之、匍匐茎最低，根和叶中表达量分别为匍匐茎的4.47倍和9.56倍；荫蔽0、2、4、6、8和12 h处理中，AsMYB44表达在6 h和8 h显著上调，分别为0 h的11.35倍和9.52倍；OE1、OE2、OE3和OE4中AsMYB44表达量分别为WT的6.09、4.69、3.26和3.43倍，PCR分析显示转基因株系和质粒组获得923 bp目标DNA片段而WT未获得。3.4 荫蔽胁迫下过表达AsMYB44对生长、光合能力和抗氧化系统的影响：正常光照下过表达株系叶宽较WT显著减小，OE1减小22.6%；与正常光照相比，荫蔽使WT绿叶比例降低83.8%，使OE1显著降低31.7%；荫蔽使WT叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量、净光合速率（Pn）、气孔导度（gs）和蒸腾速率（Tr）分别降低62.9%、80.5%、54.9%、91.5%、56.0%和64.0%，使OE1分别降低16.2%、34.4%、16.5%、51.4%、23.5%和35.3%；荫蔽使WT叶绿素a/b比值和胞间CO₂浓度（Ci）分别升高90.9%和38.2%，使OE1分别升高27.7%和21.2%；荫蔽下过表达株系叶长、叶宽、绿叶比例、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量、Pn、gs和Tr显著高于WT，叶绿素a/b比值和Ci低于WT；荫蔽使WT的SOD、POD和CAT活性分别降低83.9%、97.2%和86.8%，使OE1分别降低47.8%、66.5%和11.8%；荫蔽使WT的MDA含量和EL分别增加6.7倍和8.6倍，使OE1分别增加2.6倍和2.9倍；荫蔽下过表达株系SOD、POD和CAT活性显著高于WT，MDA含量和EL低于WT。3.5 差异表达基因的富集与特征：转录组样本中过表达株系（OE1和OE2）与WT组间显著分离而组内聚类良好；OE1 vs. WT鉴定出58,623个DEGs（17,038个下调、41,585个上调），OE2 vs. WT鉴定出59,067个DEGs（18,172个下调、40,895个上调），两组比较共有55,204个DEGs显著重叠；GO富集最显著的条目与蛋白合成和翻译相关（核糖体、翻译、核糖体结构成分），此外四吡咯结合和血红素结合等与叶绿素合成及能量代谢相关条目高度富集，酰胺生物合成过程和细胞酰胺代谢过程也显著激活；KEGG富集最显著通路为核糖体，此外次生代谢物生物合成、苯丙烷生物合成及亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢等脂质代谢通路高度富集；与WT相比，过表达株系中富集于光系统II的上调基因共19个（含AsPsbA、AsPsbB等），富集于光系统I的上调基因共11个（含AsPsaA、AsPsaD等），富集于细胞色素b6/f复合体的上调基因共3个（AsPetA、AsPetB、AsPetC），富集于光合电子传递蛋白的上调基因共13个（含AsPetE、AsPetF、AsPetH），富集于F型ATP酶亚基的上调基因共6个（AsAtpF、AsAtpD、AsAtpH、AsAtpG）；富集于光系统I捕光复合体叶绿素a/b结合蛋白的上调基因共8个（AsLHCA1至AsLHCA5），富集于光系统II捕光复合体叶绿素a/b结合蛋白的上调基因共62个（AsLHCB1至AsLHCB7）；叶绿素相关通路共富集18个DEGs，其中12个上调（含AsHemC、AsHemD、AsHemL、ChlI、AsChlI、AsChlM、AsChlE、AsChlG、AsCAO），6个下调（含AsNOL和AsSGR）；qRT-PCR验证显示过表达株系中AsPIL15和AsSGR表达下调，AsPsaD、AsPsaE、AsPsaH、AsPHYB、AsPSY3、AsCAO、AsLHC3和AsLHC4表达上调。

讨论部分总结：MYB44在植物生物与非生物胁迫响应及代谢调控中发挥关键作用，但其在匍匐剪股颖荫蔽响应中的确切作用尚待阐明；荫蔽6 h和8 h后AsMYB44转录水平显著升高，提示其可能参与荫蔽胁迫响应通路，组织特异性分析显示其主要在叶片表达。荫蔽下植物通常通过调节形态性状、光合性能和抗氧化系统进行适应；正常光照下过表达株系叶宽显著低于WT，这种生长代价提示存在生长-防御权衡，窄叶可减少相互遮荫并使更多入射光到达冠层下部叶片，与WT绿叶比例降低83.8%而OE1仅降低31.7%的结果一致；荫蔽下WT的Pn和叶绿素b含量分别严重降低91.5%和80.5%，而OE1仅降低51.4%和34.4%，表明过表达AsMYB44有效缓解荫蔽诱导的光合退化；经典耐荫理论认为植物通常降低叶绿素a/b比值以扩大捕光天线，但本研究中荫蔽使两种基因型该比值均显著升高，且WT升高幅度远大于OE1，过表达株系较温和的叶绿素a/b比值提示两个光系统间更平衡的化学计量；WT抗氧化防御几乎崩溃，POD活性降低97.2%，MDA含量增加6.7倍，EL增加8.6倍，而过表达株系维持显著更高的SOD、POD和CAT活性并有效限制MDA积累和电解质渗漏，与某些MYB转录因子负调控抗氧化酶基因并促进衰老的报道相反，本研究显示AsMYB44具有正向调控作用。转录组分析表明，过表达AsMYB44主要增强荫蔽下光合作用、光合作用天线蛋白和叶绿素代谢通路基因的表达，提示AsMYB44可能作为光合适应荫蔽的正向调控因子，通过激活捕光复合体基因和叶绿素生物合成酶表达维持有限光照下高效的能量捕获和电子传递；机制上，AsPIL15和AsSGR下调及AsPHYB上调提示光/荫蔽信号改变和叶绿素降解延迟，但AsMYB44是否直接结合这些靶基因尚待验证；一个可检验的工作模型是AsMYB44过表达维持PSI/PSII、LHC、电子传递和ATP酶组分及叶绿素合成基因表达，同时抑制AsSGR/AsNOL介导的叶绿素降解，从而维持光捕获和电子传递能力、Pn和碳水化合物并限制ROS过量产生，随后维持的抗氧化酶活性构成第二道防线。研究结论翻译：综上，AsMYB44调控植物耐荫性；过表达AsMYB44增强了匍匐剪股颖的耐荫性，体现在植株形态、光合能力和抗氧化酶活性上；更重要的是，AsMYB44可能间接维持与光合作用、光合作用天线蛋白和叶绿素代谢相关基因的表达。