基于P32特异性单克隆抗体的牛结节性皮肤病病毒即时检验免疫层析试纸条的研制与初步评价

《Sensors》：A Novel Point-of-Care Immunochromatographic Strip for Lumpy Skin Disease Virus: Leveraging P32-Specific Monoclonal Antibodies for Enhanced Field Surveillance

　　

牛结节性皮肤病（LSD）是一种牛跨界传播的病毒性疫病，快速抗原检测可支持现场监测与疫情调查。本研究旨在研制并初步评价一种靶向牛结节性皮肤病病毒（LSDV）P32蛋白的胶体金免疫层析试纸条。研究人员在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达重组P32蛋白，并采用杂交瘤技术制备了两株P32特异性单克隆抗体5B1与7H4。利用截短P32片段的间接ELISA结果显示，两株抗体主要与P32-1（第13–60位氨基酸）反应，但其精确表位尚未确定。在测试的四种抗体组合中，以胶体金标记5B1、固定7H4的组合产生的检测线信号最强，被选用于试纸条研制。使用重组His标签P32蛋白，三次重复试验中稳定检出的最低浓度为40 μg/mL，结果于15 min后判读。该试纸条与LSDV悬液及LSDV阳性皮肤结节组织反应，而与所选异源病毒制品及阴性对照均未出现阳性反应。在对30份牛临床样本的评价中，试纸条检出11份qPCR阳性样本中的9份，并正确判定全部19份qPCR阴性样本。以qPCR为参比方法，阳性符合率为81.82%（95% CI，48.22–97.72%），阴性符合率为100%（95% CI，82.35–100%），总符合率为93.33%。上述结果证明基于P32的抗原检测试纸条具有可行性，但其诊断性能仍需在更大且更具代表性的样本集中进一步评价。

牛结节性皮肤病（LSD）由牛结节性皮肤病病毒（LSDV）引起，具有高传播性和严重发病率等流行病学特征，1929年首次在赞比亚报道，此后在非洲广泛传播，2013年传入土耳其并进一步扩散至亚洲内陆和欧洲，2015年首次传入欧洲，至2022年已东扩北扩至蒙古国和西伯利亚东部。LSDV环境适应性强，除传统宿主牛外，还可自然感染羚羊、骆驼、瞪羚等多种野生动物，越南动物园的长颈鹿中亦检出该病毒。发病后全身皮肤和黏膜出现结节性病变，可发展为开放性创口并继发细菌感染，严重影响牛皮加工和产奶。LSDV属痘病毒科（Poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）羊痘病毒属（CaPV），与山羊痘病毒（GTPV）、绵羊痘病毒（SPPV）基因组核苷酸同源性达97%且血清学交叉保护，为双链DNA病毒，基因组约151 kb，含156个推定基因，病毒颗粒呈砖形或卵圆形。常用分子检测基因包括ORF101、ORF126、GPCR基因、ORF074等，其中ORF101与ORF126为实时荧光PCR国家标准基因。P32蛋白由ORF075编码，位于LSDV表面，是CaPV与LSDV共有的主要结构蛋白，属内同源性88.3–99.8%，含主要抗原表位、免疫原性强，可刺激宿主产生抗体，但在感染初期不能阻止攻击部位病毒复制，在LSDV致病性、诊断和防控中具有重要作用。现有检测以分子方法为主，缺乏适用于现场快速筛查的抗原检测手段，因此研究人员以重组LSDV P32蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合技术筛选高滴度、高特异性抗LSDV P32单克隆抗体（mAb），并通过抗体配对筛选建立快速便捷的胶体金免疫层析试纸条检测方法，以期为临床LSD感染的早期诊断提供依据。

在技术方法上，研究人员以LSDV阳性样本DNA为模板扩增P32基因，构建pET30b-P32与pMAL-C4x-P32重组质粒，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中经IPTG诱导表达，分别以Ni-NTA亲和层析和淀粉酶亲和层析纯化His标签与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签P32蛋白并进行免疫印迹分析；以纯化His-P32免疫BALB/c小鼠，经PEG1500融合脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，经间接ELISA筛选和三轮有限稀释亚克隆获得5B1与7H4两株杂交瘤细胞，经腹水制备和Protein G亲和层析纯化抗体并测定亚型；将P32分为P32-1、P32-2、P32-3三个不重叠片段进行表位区定位；以柠檬酸三钠还原法制备胶体金并经紫外-可见光谱和透射电镜表征，优化抗体配对后组装试纸条；临床样本来自2023年6月至2025年6月中国内蒙古自治区不同地区（含中蒙边境地区）采集的牛血清、鼻咽拭子和直肠拭子，共采集2000余份，本次从中选取30份采样时无明显临床症状的牛样本进行初步评价，以qPCR（依据GB/T 39602–2020）为参比方法。

研究结果方面，3.1 重组P32表达质粒的构建与验证：PCR扩增获得约849 bp和842 bp的预期产物，MluI/XhoI酶切pET30b-P32产生约1614 bp和4404 bp片段，ApaI/HindIII酶切pMAL-C4x-P32产生约2839 bp和4560 bp片段，DNA测序进一步确认两个重组构建体正确。3.2 重组P32蛋白的表达、纯化与免疫反应性：SDS-PAGE显示His-P32存在于可溶与不可溶组分，不可溶组分中约35 kDa条带更明显，自可溶组分经镍亲和层析纯化后，可与抗His单克隆抗体及LSDV阳性牛血清反应；MBP-P32主要存在于可溶组分，经淀粉酶亲和层析纯化后与抗MBP单克隆抗体及LSDV阳性牛血清反应。3.3 抗P32单克隆抗体的制备、特性与表位区定位：免疫小鼠血清对重组MBP-P32反应性明显高于未免疫对照，4号小鼠应答最高被选用于脾细胞融合，经三轮有限稀释亚克隆获得5B1和7H4两株稳定杂交瘤；间接ELISA显示两株抗体与P32-1及P32-MBP强反应，与P32-2、P32-3及单独MBP仅呈背景水平信号，提示P32-1（第13–60位氨基酸）含两株抗体识别的区域，但精确表位未能确定；亚型分析显示5B1为IgG2b、7H4为IgG2a，均含κ轻链。3.4 胶体金纳米颗粒的表征：胶体金悬液澄清呈酒红色，紫外-可见光谱在523 nm处呈单一吸收峰，透射电镜显示视野内颗粒呈球形至卵圆形。3.5 试纸条的优化与分析性能：四种配对中，胶体金标记5B1加固定7H4（第3组）检测线信号最强被选用；检测线强度随重组His-P32浓度降低而减弱，40 μg/mL（1:75稀释）时三次重复均出现可见检测线，更低浓度信号微弱、不一致或缺失，PBS对照无检测线；特异性评价中LSDV悬液和LSDV阳性皮肤结节组织浸液出现检测线，PBS、DMEM、灭活口蹄疫病毒（FMDV）疫苗、灭活牛病毒性腹泻病毒（BVDV）疫苗、灭活牛疱疹病毒1型（BHV-1）疫苗、MDBK细胞冻融悬液及正常牛皮肤组织浸液均无检测线。3.6 试纸条与qPCR在临床样本中的符合性：30份样本中11份qPCR阳性（含初测Ct值35.2和35.6后确认阳性的2份），试纸条检出其中9份，19份qPCR阴性样本全部阴性，阳性符合率81.82%（9/11；95% CI，48.22–97.72%），阴性符合率100%（19/19；95% CI，82.35–100%），总符合率93.33%（28/30）。

讨论部分指出，快速抗原检测可作为LSD监测和疫情调查中分子检测的有益补充。P32是羊痘病毒属主要结构蛋白，既往已有基于截短P32的间接ELISA、P32特异性单克隆抗体双抗体夹心ELISA以及基于P32和L1R的抗体ELISA研究，本研究进一步在胶体金免疫层析形式中评价P32特异性单克隆抗体。两株抗体主要与P32-1反应，提示N端区域含两者识别的决定簇，但与截短重组蛋白反应不能确定表位的精确位置和性质，现有数据也无法判断5B1与7H4识别相同、重叠还是不同结合位点。抗体配对是夹心免疫分析的重要考虑因素，第3组信号最强被选用于进一步评价；胶体金免疫层析法也已用于非洲猪瘟病毒等其他兽医病原检测。以重组His-P32检测时40 μg/mL在三次重复中稳定检出，但不应视为正式建立的检出限，重复数少限制估计精度，对纯化重组P32的响应也不能直接反映自然感染动物抗原的检出，需用浓度范围明确的临床材料进一步评价。试纸条对LSDV悬液和阳性皮肤结节组织浸液呈阳性，对所选FMDV、BVDV、BHV-1等阴性对照无检测线，仅为在所检材料范围内的初步分析特异性证据；未纳入绵羊痘病毒和山羊痘病毒，而P32在羊痘病毒属中保守，与这些近缘病毒的交叉反应仍是重要未决问题，在确认其LSDV特异性前需补充试验。与qPCR比较中，2份未检出样本初测Ct值为35.2和35.6，核酸水平较低可能影响抗原检测结果，但Ct值本身不能确定抗原浓度，样本组成和抗原可及性差异等因素亦可能影响试纸条性能；qPCR作为参比方法而非独立建立的诊断金标准，符合率估计不应解释为临床敏感性或特异性的确定指标。局限性包括：临床评价仅纳入30份采样时无明显临床症状的选定样本，未进行基因组特征分析，样本量小且经过选择限制了符合率估计的精度和推广性，尤其对具典型皮肤病变或其他LSD症状的动物；纳入不同样本类型可能影响检测性能，但现有数据不足以支持样本类别间的可靠比较；分析评价抗原浓度和重复数有限，特异性panel未含其他羊痘病毒。结论部分译为：研究人员制备了两株P32特异性单克隆抗体5B1和7H4，并用于研制检测LSDV抗原的双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条；该试纸条在所测临床样本中与qPCR显示良好符合性，且与本研究纳入的异源病毒制品未产生可检测的交叉反应；上述结果支持其作为快速、免仪器LSDV抗原现场检测方法的潜在应用。