《Biology》：Genome-Wide Identification, Characterization, and Expression Analysis of the HD-Zip Gene Family in Quinoa (Chenopodium quinoa)
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同源域-亮氨酸拉链（homeodomain-leucine zipper, HD-Zip）蛋白是调控植物生长发育及非生物胁迫响应的重要转录因子。然而，藜麦（*Chenopodium quinoa*）中HD-Zip基因家族的认识仍然有限。本研究在藜麦基因组中鉴定
同源域-亮氨酸拉链（homeodomain-leucine zipper, HD-Zip）蛋白是调控植物生长发育及非生物胁迫响应的重要转录因子。然而，藜麦（*Chenopodium quinoa*）中HD-Zip基因家族的认识仍然有限。本研究在藜麦基因组中鉴定出41个CqHD-Zip基因，并在系统发育上将其划分为4个亚家族。通过全基因组生物信息学方法，对上述基因的特征、染色体定位、基因结构、保守基序及系统发育关系进行了综合分析。RNA-Seq数据显示，41个HD-Zip基因中的一部分在盐胁迫下表现出表达变化，其中CqHDZ5、CqHDZ12、CqHDZ13、CqHDZ18、CqHDZ19和CqHDZ21对盐胁迫呈正响应，该结果经qRT-PCR分析得到证实。组织表达分析显示，CqHDZ5、CqHDZ13、CqHDZ18和CqHDZ21在发育中的种子中显著表达，CqHDZ12和CqHDZ19在根中高表达。此外，这6个基因的转录本水平在渗透胁迫和低温胁迫下显著上调，表明它们可能参与对盐、渗透及低温胁迫的抗性调控。上述结果表明HD-Zip是一个多功能基因家族，研究结果可为进一步分析HD-Zip基因在非生物胁迫响应中的潜在作用及藜麦遗传改良提供有价值的信息。
研究背景方面，植物生长发育常受干旱、土壤盐渍化及极端温度等不利环境因子影响，植物通过复杂的基因调控网络响应各类胁迫信号，而转录因子作为基因表达的核心调控因子在其中发挥重要作用。HD-Zip是植物特有的转录因子家族之一，其蛋白由C端同源域（homeodomain, HD）和相邻的亮氨酸拉链（leucine zipper, LZ）结构域组成，HD可特异性结合DNA，LZ介导蛋白二聚化；依据序列保守性、基因结构及顺式元件可划分为HD-Zip I、II、III、IV四个亚家族，其中HD-Zip III和IV除HD、LZ外还含有类固醇生成急性调控蛋白相关脂质转移（START）结构域及START相关结构域（SAD），HD-Zip III另具MEKHLA结构域。自玉米中首个含HD的Knotted1基因被分离以来，多个物种中已通过全基因组分析鉴定出众多HD-Zip转录因子，并报道其在植物多个生物学过程中的关键作用。藜麦是源自南美洲安第斯地区的双子叶作物，营养丰富，与甜菜（*Beta vulgaris* L.）和菠菜（*Spinacia oleracea* L.）同属藜科，因其抗氧化、抗肥胖、抗癌、抗菌、抗糖尿病及有益心血管等健康特性而受到消费者青睐，并因其对极端气候和土壤条件的非凡适应性而日益受到研究者关注。然而，藜麦中HD-Zip基因家族的研究仍十分有限。为此，研究人员开展了本研究，旨在鉴定藜麦HD-Zip家族成员并解析其蛋白理化性质、染色体分布、系统发育关系、基因结构及基序位置，同时对盐胁迫下藜麦根进行转录组测序以筛选响应基因，并进一步检测其在渗透、低温胁迫及不同组织中的表达模式。研究共鉴定出41个CqHD-Zip基因，系统发育分析将其划分至四个亚家族，盐胁迫下6个基因显著上调并经qRT-PCR证实，组织表达显示这些基因分别在发育种子和根中高表达，且均响应渗透与低温胁迫。上述结果深化了对藜麦逆境适应机制的认识，为藜麦抗逆分子育种及遗传改良提供了基因资源和理论依据。
在关键技术方法上，研究人员以拟南芥HD-Zip家族蛋白序列为查询序列，通过本地BLASTP（E值<10
?5）检索藜麦基因组数据库，并利用SMART及NCBI CDD确认HD（PF00046）、LZ（PF02183）、START（PF01852）、MEKHLA（PF08670）结构域；使用ExPASy ProtParam分析蛋白长度、分子量及等电点，ORF Finder确定开放阅读框，PSORT进行亚细胞定位预测，TBtools-II绘制染色体分布图。采用ClustalW进行多序列比对，MEGA 5.0以邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统发育树（Poisson模型、完全删除、1000次自举重复）。基因结构经GSDS 2.0可视化，保守基序经MEME分析（最多20个基序，宽度6~50个氨基酸，E值<10
?2）。表达分析所用盐处理根RNA-Seq数据来源于研究人员前期研究，以每千碱基转录本每百万映射读段片段数（FPKM）衡量表达水平，HemI绘制热图。实验材料为江苏省农业科学院提供的藜麦品种"苏藜1号"，组织表达分析采集28日龄幼苗的根、茎、叶及生殖期的花和授粉后10、20、30天（DAP）的发育种子；水培至第六片真叶期的幼苗分别接受盐处理（300 mM NaCl）、渗透处理（20% PEG 6000）和低温处理（4 °C），于0、3、6、12、24 h采集根样，每样本设3个独立生物学重复。RNA提取后经qRT-PCR分析，以UBA2B为内参基因，采用2
?△△CT法计算相对表达量。
研究结果方面，第一，HD-Zip基因鉴定：以拟南芥HD-Zip蛋白序列为参考在藜麦基因组数据库中进行BLASTP检索，保留含HD结构域的候选蛋白用于系统发育分类，依据系统发育位置和保守结构域架构将蛋白归入相应亚家族，共获得41个藜麦HD-Zip基因，按染色体位置命名为CqHDZ1至CqHDZ41；其ORF长度为549 bp（CqHDZ33）至2547 bp（CqHDZ37），氨基酸数为182至848个（平均452个），分子量为20.91 kDa（CqHDZ33）至92.30 kDa（CqHDZ37），等电点为4.62（CqHDZ32）至9.37（CqHDZ15）；亚细胞定位预测显示33个蛋白定位于细胞核、5个（CqHDZ2、CqHDZ7、CqHDZ29、CqHDZ38、CqHDZ40）定位于细胞质、3个（CqHDZ3、CqHDZ31、CqHDZ37）定位于叶绿体，该结果仅为计算机预测，尚需实验验证。第二，系统发育分析与类群划分：对41个藜麦CqHD-Zip蛋白与48个拟南芥AtHD-Zip蛋白进行多序列比对并构建NJ树，89个HD-Zip蛋白被划分为I至IV四个亚家族，分别含36、17、12和24个成员；41个CqHDZs分布于全部四个亚家族，其中HD-Zip I含19个成员为最大类群，HD-Zip II和III各含7个，HD-Zip IV含8个；同一亚家族蛋白功能相似，如CqHDZ13与AtHB54聚类于同一分支提示二者可能具有相似生物学功能，HD-Zip I亚家族中CqHDZ5、CqHDZ19、CqHDZ25、CqHDZ33与AtHB7、AtHB12同分支且同源性较高。第三，染色体分布：染色体定位显示CqHD-Zip基因不均匀分布于藜麦18条染色体中的16条上，多位于染色体远端，Chr3和Chr11上未发现CqHD-Zip基因，CqHDZ39、CqHDZ40和CqHDZ41未能准确定位于染色体而命名为Chr 0；Chr1含5个CqHDZs为最多，Chr6和Chr16各含4个，Chr2、Chr5、Chr8、Chr9、Chr12和Chr17各仅含1个基因，Chr4和Chr18各含2个，Chr7、Chr10、Chr13、Chr14和Chr15各含3个；部分基因在同一染色体上密集分布，可能与基因复制事件有关。第四，基因结构与保守基序分析：通过比较基因组序列与对应cDNA序列分析内含子与外显子组成，发现不同CqHDZs的UTR、内含子和外显子数目差异较大，UTR数为0至5个，内含子数为1至18个，外显子数为2至19个；HD-Zip I和II亚家族基因结构相对简单，内含子数分别为1至2个和2至4个，HD-Zip III亚家族基因结构最复杂，含16至18个内含子，HD-Zip IV含7至11个内含子；同一系统发育分支上的基因结构相似，如HD-Zip I亚家族的CqHDZ11和CqHDZ26均含2个内含子和3个外显子，HD-Zip II亚家族的CqHDZ24和CqHDZ34均含3个内含子和4个外显子，进一步证实了藜麦HD-Zip分类结果；值得注意的是CqHDZ30与CqHDZ41具有相同CDS序列，可能为源于未定位scaffold Chr00的组装冗余。利用MEME分析保守基序，最终确定20个保守基序，长度21至50个氨基酸残基，各成员所含基序数目和类型不同，但均含位于HD结构域的motif 1，表明该家族的保守性；不同亚家族基序组成的复杂性与基因结构复杂性相似，HD-Zip III基序数最多（14至16个），HD-Zip IV次之（12至14个），CqHD-Zip II全部成员均含位于HD和LZ核心结构域的3个基序（motif 1、motif 2和motif 3）；基序组成与分布的差异预示不同基因具有不同生物学功能，同一亚家族成员结构组成相似且聚类在一起，有力支持了进化树分类的可靠性。第五，盐胁迫下表达谱：结合研究人员前期转录组数据绘制300 mM NaCl不同时间点处理下CqHD-Zip基因表达热图，发现盐胁迫下该家族基因表达模式存在一定差异，其中CqHDZ1、CqHDZ6、CqHDZ10、CqHDZ23、CqHDZ30、CqHDZ36和CqHDZ41共7个基因表达水平未发生变化，提示其可能不参与盐胁迫响应，其余34个基因在不同盐处理时间点呈不同程度变化；CqHDZ9和CqHDZ22在0.5 h和2 h下调、24 h上调，CqHDZ4表达模式相反；随盐处理时间延长，CqHDZ25和CqHDZ33表达先升高、后降低、再升高；CqHDZ5、CqHDZ12、CqHDZ13、CqHDZ18、CqHDZ19和CqHDZ21受盐胁迫诱导，而CqHDZ8、CqHDZ17、CqHDZ28和CqHDZ32受盐处理抑制；选取上述6个盐诱导CqHDZs进行qRT-PCR验证，结果与RNA-Seq一致。第六，组织特异性表达模式：通过qRT-PCR分析6个盐诱导基因在不同组织和种子发育阶段的相对表达水平，发现CqHD-Zip基因组织表达广泛，提示其可能发挥不同调控作用；CqHDZ5、CqHDZ13、CqHDZ18和CqHDZ21在全部发育阶段种子中表达水平最高，CqHDZ12和CqHDZ19在根中表达水平最高；CqHDZ18和CqHDZ19虽在种子和根中相对表达较高，但在茎、叶和花中表达极低或不表达；上述表达模式提示CqHD-Zip基因可能参与藜麦种子和根发育，其生物学功能尚需功能验证。第七，响应其他非生物胁迫的表达分析：利用qRT-PCR检测渗透和低温条件下藜麦幼苗根中CqHD-Zip基因的RNA转录水平，渗透胁迫处理后6个基因均呈差异积累且均被显著诱导，表达水平于24 h达峰值，分别上调至3.98、2.71、13.93、11.14、21.79和3.41倍；低温胁迫处理后6个基因较对照（0 h样本）均上调，表达水平于24 h最高，分别上调至2.71、1.66、2.67、2.96、1.64和1.59倍，尽管低温胁迫下倍数变化温和，但这些轻微表达变化可能具有功能相关性；结果表明CqHDZ5、CqHDZ12、CqHDZ13、CqHDZ18、CqHDZ19和CqHDZ21可能在渗透和低温胁迫响应中发挥重要作用。
讨论部分总结如下：不利环境条件如盐渍、高温、低温、干旱、氧化胁迫和有毒金属对植物生长发育具有破坏性影响，可显著降低作物产量和品质并造成重大经济损失，据估计全球约20%和22%的耕地受干旱和盐渍化影响，使受影响地区作物减产超过50%；植物为适应逆境进化出包括胁迫感知、信号转导及诱导胁迫响应基因表达在内的复杂调控途径。随着植物基因组测序完成和全基因组数据库公布，越来越多胁迫响应基因被鉴定，其中植物基因家族鉴定与分析是挖掘关键功能基因的有效手段；转录因子作为关键分子开关，通过开启或抑制众多基因调控生理生化过程以维持植物正常生长和生存，植物特有的HD-Zip转录因子被认为对植物发育调控及多种环境胁迫响应至关重要。藜麦因其高营养价值、遗传多样性及对逆境的高适应性，在干旱地区退化土地和沿海盐碱地开发中可发挥战略作用；此前对藜麦同源盒超家族的全基因组调查已将HD-Zip候选基因纳入该大型转录因子家族，但针对藜麦HD-Zip家族的系统梳理和功能表征仍然有限。本研究对藜麦CqHD-Zip基因进行了全面鉴定与分析，共鉴定出41个成员，较此前研究多7个，两项研究间有30个基因重叠，新鉴定11个HD-Zip基因，差异归因于研究人员在去除不一致基因后新鉴定的11个基因；同时分析了该基因家族的系统发育关系、染色体分布、基因结构、保守基序及多种非生物胁迫和不同组织下的表达谱。藜麦HD-Zip基因数目与辣椒（40个成员）相近，多于水稻（31个成员），但低于拟南芥（48个）和玉米（55个），这可能与基因组进化过程中发生的序列复制事件有关；亚细胞定位预测显示多数CqHD-Zip家族成员定位于细胞核，部分分布于细胞质，可作为转录因子调控下游靶基因，与既往研究一致，此外CqHDZ3、CqHDZ31和CqHDZ37为叶绿体定位转录因子，提示其可能在植物光合作用中具有潜在功能。系统发育分析将CqHD-Zip家族划分为四个亚家族，与既往研究一致；拟南芥HD-Zip I亚家族组成较其他三个亚家族更多样，可能因其进化上更为古老，有更多时间发生基因复制和重排，藜麦中HD-Zip I同样为成员数最多的亚家族，与既往研究相符；据报道HD-Zip III是各物种间最保守的亚家族，本研究系统发育结果亦支持藜麦HD-Zip III蛋白的高度保守性。基因结构特征为系统发育分析提供补充信息并在基因家族进化中起重要作用，保守基序可反映其特定生物学功能；本研究发现系统发育树同一亚家族中的CqHDZs在基因结构和基序排列上相似，表明不同亚家族CqHDZs的功能在进化过程中逐渐变化从而帮助生物适应外部环境变化，该结果进一步证实了系统发育树亚组分类的准确性；motif 1、motif 2和motif 3等基序出现频率较高，揭示其对CqHD-Zip蛋白功能的重要性；CqHD-Zip I和CqHD-Zip II成员内含子相对较少且基序组成与CqHD-Zip III和IV亚家族不同，且CqHD-Zip I蛋白与CqHD-Zip II同源性高；既往研究注意到内含子数目与植物基因环境响应性之间存在潜在关联，结合本研究观察到的内含子特征，CqHD-Zip I和CqHD-Zip II成员可能参与生物和非生物胁迫响应。大量研究发现HD-Zip I蛋白在植物多种非生物胁迫响应中起极其重要的作用，HD-Zip II亚家族蛋白次之；基因表达分析对功能预测至关重要，基于转录组数据，不同CqHDZs在盐胁迫下表达存在明显差异，7个基因不参与盐胁迫响应，其余34个基因在盐胁迫期间差异表达，其中部分基因在不同胁迫时间点表达变化不规则，可能在一个时间点上调而在另一时间点下调；CqHDZ5、CqHDZ12、CqHDZ13、CqHDZ18、CqHDZ19和CqHDZ21在盐处理下持续上调，提示其作为盐胁迫响应调控因子的潜在功能，qRT-PCR验证结果高度一致；CqHDZ5、CqHDZ13、CqHDZ18和CqHDZ19属于HD-Zip I亚家族，CqHDZ12和CqHDZ21属于HD-Zip II亚家族，与既往结果相符；6个基因呈现组织和器官特异性表达谱，多在种子和根中高表达，qRT-PCR结果显示其在渗透和低温处理下均显著上调且两种处理下转录水平变化趋势相似，表明这些基因在藜麦渗透胁迫和低温胁迫响应中具有潜在功能。本研究基于短读长RNA-seq数据表征CqHDZ基因表达模式，需注意藜麦为异源四倍体物种，许多CqHDZ基因以高度相似的同源拷贝存在，来自同源拷贝共享保守区的短测序读段倾向于映射到多个基因组位点，限制了短读长数据准确解析同源拷贝特异性表达的能力，因此本文呈现的表达结果无法完全区分来自单个同源拷贝的转录信号；为可靠地将转录本归属到特定同源拷贝、验证基因模型并鉴定可变剪接异构体，未来研究需要全长转录本测序并与短读长定量相结合。总体而言，CqHD-Zip为多功能基因家族，CqHDZ5、CqHDZ12、CqHDZ13、CqHDZ18、CqHDZ19和CqHDZ21在藜麦种子和根中高表达，可能在盐、渗透和低温等非生物胁迫响应中发挥重要作用；研究结果不仅为进一步理解CqHD-Zip蛋白调控机制奠定基础，也为藜麦抗性遗传改良提供新视角。研究结论部分翻译如下：本研究在藜麦基因组中共鉴定出41个HD-Zip转录因子，随后将其划分为亚家族I、II、III和IV；对其理化性质、染色体位置、外显子-内含子结构、保守基序、系统发育关系及表达进行了综合分析；上述发现为进一步研究HD-Zip基因在非生物胁迫响应中的作用及藜麦遗传改良奠定了坚实基础。
