EO771B来源的转移性乳腺癌模型在可检测到骨髓播散前即表现出RANKL相关骨免疫重塑

《Biology》：An EO771-Derived Metastatic Breast Cancer Model Exhibits RANKL-Associated Osteoimmune Remodeling Before Detectable Bone-Marrow Dissemination

　　

骨转移传统上被视为乳腺癌进展的晚期表现。然而，越来越多的证据提示，全身性骨骼改变可能在明显肿瘤播散之前即已出现，从而提出骨免疫重塑可能促进许可性骨骼微环境形成的可能性。研究人员所在团队的前期临床前研究表明，转移性4T1乳腺癌与表达RANKL的适应性免疫细胞群扩增及BALB/c小鼠早期骨骼改变相关。在另一种同系免疫健全乳腺癌模型中是否发生类似的骨免疫改变仍不清楚。本研究通过对EO771细胞在免疫健全C57BL/6宿主中原位、血行及骨相关压力下进行连续多部位体内选择，建立了EO771来源的转移性乳腺癌细胞群（EO771B）。与亲本细胞相比，EO771B表现出向骨髓的自发性播散，而在所评估的实验条件下未检测到亲本EO771细胞的骨髓播散，同时两组向肿瘤引流淋巴结（dLNs）的播散及原发肿瘤生长无显著差异。微计算机断层扫描（MicroCT）显示，原位接种后第11天即出现显著的小梁骨退化，早于本研究所用克隆形成实验可检测到骨髓播散的时间，并在肿瘤进展后期观察到小梁骨微结构的进一步改变。这些骨骼改变伴随骨髓中表达RANKL的CD4⁺ T细胞及CD19⁺ B淋巴细胞频率和/或数量的增加，尽管在早期时间点未检测到肿瘤来源集落。在肿瘤进展过程中，表达RANKL的CD4⁺ T细胞群在肿瘤引流淋巴结及原发肿瘤微环境中亦增加。将肿瘤驯化的白细胞过继转移至淋巴细胞缺陷的Rag1^?/?受体小鼠可重现小梁骨退化，表明肿瘤驯化白细胞可在功能上促进骨骼重塑，尽管淋巴细胞来源RANKL的具体贡献未被直接检验。综上，这些结果表明EO771B肿瘤进展与骨免疫改变相关，其特征为表达RANKL的淋巴细胞群增加及在克隆形成实验可检测到骨髓播散之前出现小梁骨退化。结合研究人员此前在另一种同系乳腺癌模型中的发现，这些结果支持肿瘤相关骨免疫重塑在不同肿瘤-宿主系统中均可发生，并确立EO771B–C57BL/6模型作为进一步机制研究的平台。

**研究背景与科学问题**

骨转移传统上被视为乳腺癌进展的晚期事件，通常在全身播散和明显骨骼病灶建立后才被临床识别。然而，越来越多的流行病学和临床证据提示，骨骼稳态紊乱可能在乳腺癌演化过程中更早出现。骨密度（BMD）改变、骨量减少和骨质疏松患病率升高、骨折易感性增加以及骨转换改变已在不同乳腺癌人群中被报道，包括无临床可检测骨骼转移的新诊断患者以及尚未长期接受全身治疗者。但这些发现存在异质性甚至矛盾之处，不同研究依据绝经状态、种族和临床背景报告诊断时BMD升高或降低。因此，单纯的静态骨量测量可能不足以反映肿瘤进展过程中骨骼微环境内的动态生物学过程。

骨重塑是受激素、机械、炎症和免疫来源信号持续调控的稳态过程，这些信号协调成骨细胞和破骨细胞活性。在肿瘤背景下，这一严密调控的平衡被破坏可能改变骨骼微环境的细胞和分子组成，进而影响其对后续转移定植的易感性。在连接全身肿瘤进展与骨骼重塑的机制中，免疫介导的骨稳态调控尤为相关。骨免疫学已确立免疫细胞与骨骼细胞之间广泛的功能性相互作用，活化的免疫细胞群可直接影响破骨细胞生成和骨吸收。在调控这些相互作用的分子通路中，RANK-RANKL-OPG轴通过协调破骨细胞分化、骨吸收、淋巴器官发育和适应性免疫应答而占据核心地位。持续炎症信号和包括RANKL在内的破骨细胞生成介质的持续产生已涉及慢性炎症性疾病和恶性肿瘤中的病理性骨重塑。然而，肿瘤相关适应性免疫应答是否在转移播散之前即足以参与这些骨免疫通路以修饰骨骼微环境，在乳腺癌中仍不完全清楚。研究人员近期在人类乳腺癌中的发现表明，产生OPG的B细胞和表达RANKL的T细胞定义了与后续骨转移发生相关的免疫特征，支持这些骨免疫细胞群的临床相关性。

在免疫健全小鼠中探索乳腺癌进展时，研究人员团队此前证明骨骼改变可能在明显骨转移之前出现，而非仅仅是已建立骨骼定植的结果。将转移性4T1乳腺癌原位注射到BALB/c小鼠中的实验证据表明，肿瘤相关产生RANKL的适应性免疫细胞群（尤其是CD4⁺ T淋巴细胞）的扩增先于可检测的骨定植，并通过增强破骨细胞生成活性促进早期溶骨性改变，有助于转移前生态位形成和后续骨转移建立。相反，以局限于乳腺部位的非转移性67NR同胞肿瘤细胞原位接种为模型的研究也能诱导全身性骨骼改变，尽管缺乏局部侵袭或远处播散。67NR原位肿瘤非但未促进骨丢失，反而诱导小梁骨量增加，这与IFN-γ⁺IL-10⁺CD8⁺ T细胞扩增及骨髓微环境中破骨细胞生成活性抑制相关。此外，近期证据表明非转移性环境中产生OPG的B细胞富集，可主动抑制破骨细胞生成并抑制骨转移进展。总之，这些发现表明肿瘤诱导的适应性免疫重塑可能根据肿瘤生物学行为引发溶骨性或骨保护性全身应答。因此，骨免疫重塑可能并非反映对肿瘤负荷的统一应答，而是差异化地将骨骼微环境 conditioning 为对后续转移定植的许可性或限制性状态。

尽管有证据支持乳腺癌模型中免疫介导的骨重塑调控，但仍需确定类似的骨免疫改变是否发生在不同的同系肿瘤-宿主系统中。将自发性骨髓播散与完整免疫系统相结合的实验模型对于研究肿瘤进展、适应性免疫应答和骨骼重塑之间的时间关系尤为有价值。在此背景下，EO771乳腺癌细胞系为免疫健全C57BL/6小鼠研究提供了同系模型。C57BL/6背景还具有广泛可用的基因修饰和转基因小鼠品系的额外优势，可随后用于机制研究。为满足这一实验需求，研究人员通过在同系免疫健全C57BL/6小鼠中原位、血行和骨相关压力下的连续多部位体内选择，建立了EO771来源的转移性乳腺癌细胞群（EO771B）。研究目标是建立展示自发性骨髓播散的C57BL/6模型，并研究此前在其他实验系统中发现的骨免疫改变是否也发生在EO771B肿瘤进展过程中。因此，研究人员检查了肿瘤进展、适应性免疫改变、骨骼重塑和可检测肿瘤细胞向骨髓播散之间的时间关系。

**主要关键技术方法**

研究人员采用连续多部位体内选择策略生成EO771B细胞群：将亲本EO771细胞经原位（第四乳腺脂肪垫）、静脉（眶后静脉丛）和胫骨内三条途径同时接种雌性C57BL/6小鼠，25天后从原发肿瘤、引流淋巴结、肺、肝、脾和胫骨来源骨髓中回收细胞，独立扩增后混合再接种，连续三个循环，最终经原位途径接种评估自发性播散。研究使用雌性C57BL/6野生型（WT）和Rag1缺陷（Rag1^?/?）小鼠（8–12周龄，22–25 g），来源于机构动物设施。 disseminated肿瘤细胞通过克隆形成实验评估：将引流淋巴结和髂骨来源骨髓细胞悬液系列稀释后接种6孔板，培养14天，甲醇固定、亚甲蓝染色后宏观计数集落。骨骼微结构通过MicroCT（Bruker Skyscan 1172）分析髂骨小梁区域，参数包括骨体积分数（BV/TV）、骨表面积（BS）、小梁数目（Tb.N）、厚度（Tb.Th）和分离度（Tb.Sp）。免疫表型通过流式细胞术分析引流淋巴结、肿瘤浸润淋巴细胞和骨髓中CD3、CD4、CD8、CD19、Foxp3和RANKL表达。过继转移实验将EO771B荷瘤或肿瘤-free供体小鼠引流淋巴结来源总白细胞（1×10⁶）联合可溶性EO771B肿瘤抗原（sAg；25 μg/只）经静脉转移至WT或Rag1^?/?受体，18天后MicroCT分析髂骨。

**研究结果**

**连续多部位体内选择生成具有骨髓播散的EO771来源细胞群**：通过原位接种亲本EO771和EO771B细胞，两者原发肿瘤生长动力学无显著差异，终点肿瘤重量亦无差异。克隆形成实验显示两组均向引流淋巴结播散且克隆负荷无显著差异，但仅在EO771B荷瘤小鼠骨髓中检测到克隆性肿瘤来源集落，而亲本EO771荷瘤小鼠骨髓中未检测到集落。第35天时，EO771荷瘤小鼠引流淋巴结播散检出率为60%，EO771B为80%；骨髓播散在EO771B荷瘤小鼠中检出率为100%，亲本EO771荷瘤小鼠中未检出。EO771B荷瘤小鼠脾脏重量较亲本EO771荷瘤小鼠降低，但引流淋巴结和骨髓总细胞数两组相当。这些结果表明连续选择的EO771B群体保留与亲本EO771细胞相当的原发肿瘤生长，同时展示向骨髓的自发性克隆性肿瘤细胞播散。

**早期骨骼重塑先于可检测的骨髓播散**：MicroCT分析髂骨显示，接种后第11天（D11），EO771B荷瘤小鼠已表现出与na?ve对照相比显著的小梁骨微结构改变，包括BV/TV、BS、Tb.Th和Tb.N显著降低，而BV和Tb.Sp与na?ve对照无显著差异。至第25天（D25），BV/TV、BS、Tb.Th和Tb.N仍相对na?ve对照显著改变，Tb.Sp较na?ve组显著增加。Tb.Th在D11和D25之间也存在显著差异，表明肿瘤进展过程中小梁骨微结构进一步改变。在密切对应的早期和后期时间点（分别为D10和D30）进行的独立克隆形成实验显示，早期时间点骨髓中未检测到肿瘤来源集落，而后期时间点检测到克隆性肿瘤细胞向骨髓播散。这些结果表明小梁骨退化在EO771B肿瘤进展早期即可检测到，早于本研究克隆形成实验可检测到的骨髓播散。

**EO771B进展伴随表达RANKL适应性免疫细胞群的区室特异性重塑**：在肿瘤引流淋巴结中，EO771B荷瘤小鼠总CD3⁺ T淋巴细胞相对频率在两个时间点均较肿瘤-free对照降低，而绝对数无显著差异。相反，总CD19⁺ B淋巴细胞早在第11天即表现出频率和绝对数增加，并在第25天维持。在原发肿瘤微环境中，CD3⁺ T细胞相对频率从D11至D25降低，而绝对数增加；CD19⁺ B细胞频率在D25数值上较高，绝对数在后期显著增加。调节性CD4⁺Foxp3⁺ T细胞在引流淋巴结中D25频率增加，绝对数在D11和D25均较na?ve对照增加；原发肿瘤中频率D11至D25稳定，绝对数D25显著增加。关于表达RANKL的适应性免疫群体，引流淋巴结中表达RANKL的CD4⁺ T淋巴细胞频率和绝对数在D11即较na?ve对照显著增加，并持续至D25。原发肿瘤微环境中表达RANKL的CD4⁺ T细胞频率D11至D25无显著差异，绝对数D25数值较高但未达统计学显著性。表达RANKL的CD8⁺ T细胞在引流淋巴结中D11频率不变而D25显著增加，绝对数无显著差异；原发肿瘤中频率D11至D25显著增加，绝对数无统计学变化。B细胞方面，引流淋巴结中表达RANKL的CD19⁺ B细胞频率在两个时间点均降低，但绝对数较na?ve对照显著增加，与总B细胞绝对数增加一致；原发肿瘤中频率D11至D25无显著变化，绝对数D25显著增加。这些结果表明EO771B肿瘤进展伴随早期和区室特异性的适应性免疫群体重塑，包括表达RANKL的CD4⁺ T、CD8⁺ T和B淋巴细胞改变。

**骨髓中表达RANKL淋巴细胞的早期富集先于可检测肿瘤细胞播散**：骨髓分析显示，EO771B荷瘤小鼠D11时总CD3⁺ T和CD19⁺ B淋巴细胞绝对数增加，相对频率无显著变化；这些增加在D25不再观察到。CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞相对频率与na?ve对照无显著差异，绝对数D11增加而D25不再显著不同。表达RANKL的CD4⁺ T淋巴细胞频率和绝对数在D11较na?ve对照显著增加，D25无显著差异。这一早期富集与MicroCT检测到的小梁骨改变时间一致，且发生在克隆形成实验不可检测到骨髓肿瘤细胞播散的早期实验窗口内。表达RANKL的CD8⁺ T细胞表现相似时间模式，D11频率和绝对数显著增加，D25不再检测到差异。表达RANKL的CD19⁺ B细胞在D11骨髓中频率和绝对数增加，D25无显著差异。这些结果表明EO771B肿瘤进展伴随骨髓中表达RANKL的CD4⁺ T、CD8⁺ T和B淋巴细胞的早期富集，该骨免疫表型与小梁骨退化时间一致，并先于克隆形成实验可检测骨髓播散的实验窗口。

**肿瘤驯化白细胞过继转移促进受体小鼠小梁骨退化**：将EO771B荷瘤或肿瘤-free供体引流淋巴结来源总白细胞过继转移至Rag1^?/?和WT受体，18天后MicroCT分析。接受EO771B荷瘤供体白细胞的受体与接受na?ve供体白细胞的相应对照组相比表现出小梁骨微结构改变。在WT和Rag1^?/?受体中，转移EO771B驯化白细胞均导致BV/TV和小梁厚度降低。WT受体中接受EO771B驯化白细胞者小梁分离度较接受na?ve白细胞者增加，相应Rag1^?/?受体组间亦观察到显著增加。尽管免疫背景不同，两组受体在接受肿瘤驯化白细胞后均出现BV/TV、小梁厚度和小梁分离度的一致改变。实验终点时脾脏和骨髓中表达RANKL的CD4⁺ T和CD19⁺ B细胞群在na?ve和EO771B供体白细胞受体间无显著差异，骨髓中表达RANKL细胞极少或不可检测。然而，接受EO771B荷瘤供体白细胞的受体出现了与EO771B肿瘤进展过程中观察到的相似小梁骨微结构改变。Rag1^?/?受体中的效应尤其具有信息性，因为这些动物缺乏内源性成熟T和B淋巴细胞，表明转移的白细胞群体可在该受体背景中促进骨骼重塑。这些结果表明EO771B进展期间从肿瘤引流淋巴结分离的白细胞可在过继转移后促进小梁骨退化，包括在淋巴细胞缺陷受体中，支持肿瘤驯化免疫细胞对骨骼重塑的功能性贡献。

**讨论与结论**

本研究证明EO771B肿瘤进展与表达RANKL淋巴细胞群扩增、早期小梁骨退化及随后可检测的肿瘤细胞向骨髓播散相关。值得注意的是，骨骼改变在克隆形成实验可检测骨髓播散之前即出现，并在过继转移EO771B肿瘤驯化白细胞后部分重现，支持肿瘤驯化免疫细胞对骨骼重塑的功能性贡献。这些发现强化了肿瘤进展与骨骼重塑是动态相互关联过程而非时间独立事件的概念。

研究人员团队此前使用转移性4T1肿瘤的观察表明，功能性肿瘤特异性CD4⁺RANKL⁺ T和CD19⁺RANKL⁺ B淋巴细胞扩增先于可检测骨骼播散，促进溶骨性改变并有利于后续骨转移建立。本研究中EO771B肿瘤进展重现了4T1模型中先前观察到的早期骨免疫改变，包括表达RANKL淋巴细胞群富集和骨髓播散可检测前的骨骼退化。在两种不同的同系免疫健全肿瘤-宿主系统（EO771B-C57BL/6和4T1-BALB/c）中观察到相关骨免疫表型，提示肿瘤相关骨免疫重塑不限于单一实验模型。然而，本研究结果并未确立这些系统间 underlying 机制相同。

在C57BL/6背景中建立EO771来源转移性乳腺癌模型为研究连接乳腺癌进展、免疫应答和骨骼重塑的细胞和分子机制提供了额外实验平台。亲本EO771细胞系已被表征为C57BL/6小鼠同系乳腺癌模型；然而，本研究中生成的EO771B群体在连续体内选择后未进行分子再表征，因此本研究未对所选群体指定分子亚型。与4T1-BALB/c系统一起，EO771B-C57BL/6模型使得跨具有不同生物学特征和宿主遗传背景的肿瘤进行比较研究成为可能，为剖析肿瘤内在和宿主依赖的骨免疫重塑及转移进展贡献提供了机会。重要的是，C57BL/6背景因该背景下广泛可用的基因修饰和转基因小鼠品系而进一步扩展了EO771B模型的实验多样性，有助于未来对特定细胞群体和分子通路进行机制探究。

当与研究人员在非转移性67NR设置中的观察一起考虑时，这些发现的解释变得更加复杂。与转移性肿瘤不同，67NR进展诱导骨量增加，与IFN-γ⁺IL-10⁺CD8⁺ T细胞和产生OPG的B淋巴细胞扩增相关，尽管未检测到播散。总之，这些模型提示原发乳腺肿瘤可在转移建立之前甚至在没有转移建立的情况下触发全身性骨免疫应答；然而，骨骼重塑特征似乎根据肿瘤相关适应性免疫程序而变化。转移性肿瘤在研究人员实验模型中与骨骼退化和表达RANKL群体富集相关，而非转移性肿瘤可能促进与骨量保留甚至增加相关的免疫表型。

因此，骨量变化应谨慎解释，因为骨骼能力不仅取决于骨数量，还取决于微结构组织、转换动力学和生物力学特性。这一区别在乳腺癌中尤为重要，其中骨骼转移主要为溶骨性但也可能显示混合溶骨-成骨特征，两者均导致骨骼脆性 despite 对骨量的不同影响。同样，仅BMD不能完全反映骨质量，较高BMD在某些患者队列中 paradoxically 与乳腺癌发病率或异质性临床结局相关。因此，研究人员先前研究中67NR荷瘤动物观察到的骨量增加是代表健康骨骼稳态的保存还是肿瘤诱导重塑的替代形式仍不确定。

本研究一个特别相关的观察是骨髓中表达RANKL淋巴细胞的早期富集。CD4⁺RANKL⁺、CD8⁺RANKL⁺和CD19⁺RANKL⁺群体的频率和绝对数在第11天均增加，而第25天与na?ve对照的显著差异不再检测到。这一时间模式与这些群体在早期骨骼重塑中的优先参与一致，尽管所检查的两个时间点不能确立该应答的完整动力学。类似概念已从转移前生态位形成研究中出现，其中炎症介质、基质改变和免疫细胞募集在播散肿瘤细胞到达之前生成许可性微环境。骨髓可能不仅是被动转移靶标，而是能够对全身肿瘤来源线索动态应答的免疫活性区室。早期表达RANKL淋巴细胞富集与小梁骨退化之间的时间一致性支持适应性免疫重塑与EO771B荷瘤动物观察到的骨骼应答之间的关联。然而，本实验并未确立淋巴细胞来源RANKL对观察到的骨骼改变负责。重要的是，这些观察并不意味着淋巴细胞来源RANKL构成生理性骨重塑的主导调控者，而是将其鉴定为肿瘤相关骨骼重塑背景下未来机制研究的候选通路。新出现的证据进一步提示不同形式的RANKL信号可能对生理性重塑和病理性骨骼改变有差异贡献，强化了该通路在转移进展中的背景依赖性。

EO771B进展还与肿瘤引流淋巴结和原发肿瘤微环境中表达RANKL淋巴细胞的区室特异性重塑相关。值得注意的是，这些表型改变发生 without 引流淋巴结中总CD4⁺或CD8⁺ T细胞群的相应扩增，表明表达RANKL群体的变化可能独立于这些T细胞亚群总体丰度的主要改变。CD4⁺RANKL⁺、CD8⁺RANKL⁺和CD19⁺RANKL⁺群体在淋巴和肿瘤区室间的不同行为进一步提示RANKL表达根据细胞和组织背景动态调控，而非仅反映总淋巴细胞丰度变化。

过继转移实验为肿瘤驯化白细胞对骨骼重塑的贡献提供了额外功能支持。转移EO771B肿瘤驯化白细胞在WT和Rag1^?/?受体中均降低BV/TV和小梁厚度，表明从肿瘤引流淋巴结分离的白细胞可在过继转移后促进骨骼微结构改变。该表型在Rag1^?/?受体中的发生尤其具有信息性，因为这些动物缺乏内源性成熟T和B淋巴细胞，允许在淋巴细胞缺陷背景中评估转移白细胞群体的骨骼效应。尽管实验终点时骨髓中表达RANKL淋巴细胞群极少检测到或不可检测，骨骼改变的持续可能反映转移后未被终点分析捕获的早期事件。由于可溶性抗原仅在转移时给予，实验期间无持续抗原刺激，转移细胞的表型在分析前18天间隔内也可能已改变。重要的是，由于转移的是总引流淋巴结白细胞而非纯化的表达RANKL群体，这些实验确立了肿瘤驯化白细胞的功能效应，但未将该效应归因于特定淋巴细胞亚群或证明RANKL对观察到的骨骼改变是必需的。未来使用细胞亚群特异性方法或RANKL阻断的实验将需要确立这一机制关系。

本研究发现可能有助于将过去十年关于乳腺癌患者骨稳态的明显异质性临床观察置于背景中。多项研究描述了新诊断患者或低于常规筛查阈值个体中BMD降低、骨量减少/骨质疏松患病率增加和骨折风险升高，通常在长期内分泌治疗暴露或明显骨骼转移之前。相反，其他报告将较低BMD与特定患者群体中降低的复发风险或改善的预后相关联，提示骨重塑与肿瘤进展之间比先前认识更复杂的关系。研究人员实验发现提出了以下可能性：这些明显不一致的临床模式可能并非仅反映人口学、激素或治疗相关差异，而也可能涵盖与肿瘤生物学相关的不同骨骼应答。在此背景下，转移性4T1/EO771B和非转移性67NR模型中观察到的对比表型提供了实验框架，其中生物学上不同的肿瘤与不同的骨免疫轨迹相关。尽管直接转化为患者仍有待确立，该框架提出了以下可能性：骨骼参数可能至少部分捕获疾病进展过程中发生的全身肿瘤-免疫相互作用，而非仅仅是衰老、内分泌状态或治疗毒性的后果。与这一解释一致，研究人员先前工作证明人类乳腺癌中表达RANKL的T细胞和产生OPG的B细胞免疫特征与后续骨转移结局相关，表达RANKL的T细胞群与骨转移风险增加相关，产生OPG的B细胞群与风险降低相关。这些临床观察支持此处研究的骨免疫表型的转化相关性，但未确立这些群体在人类骨骼转移中的因果作用。

解释本研究发现时应考虑若干局限性。骨髓肿瘤细胞播散使用克隆形成实验评估，该实验检测在所用培养条件下能够存活并形成集落的细胞，但不构成已建立骨转移的组织学证明。因此，早期实验时间点无集落应解释为无可检测克隆性肿瘤细胞播散，而非绝对无肿瘤细胞。此外，MicroCT识别小梁结构改变，但不直接确立导致骨丢失的细胞机制。最后，尽管过继转移实验证明肿瘤驯化白细胞对骨骼微结构的功能效应，但使用总引流淋巴结白细胞且无RANKL特异性阻断，阻止了将该效应归因于特定淋巴细胞群体或RANKL本身。这些问题现在可使用EO771B-C57BL/6系统结合细胞特异性遗传或药理学方法来解决。

总之，研究人员发现表明EO771B肿瘤进展与远端骨免疫重塑相关，发生在克隆形成实验可检测肿瘤细胞向骨髓播散之前，其特征为表达RANKL适应性免疫群体的早期富集和小梁结构的退化。在不同同系乳腺癌模型中观察到相关早期骨骼改变，以及肿瘤驯化白细胞对骨微结构的功能效应，支持肿瘤相关免疫重塑作为乳腺癌进展骨骼应答的生物学相关组成部分。因此，EO771B-C57BL/6模型为机制研究连接乳腺肿瘤、适应性免疫和骨骼微环境的细胞和分子相互作用提供了额外实验平台。