《Biology》：Antisense Oligonucleotidesin Genetic Epilepsies and Developmental and Epileptic Encephalopathies: Molecular Mechanisms, Translational Evidence and Disease-Modifying Potential
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茎蜂科（Cephidae）是膜翅目中研究相对不足的类群，多个物种的线粒体基因组数据仍然有限。Cephus nigrinus是一种主要与野生禾草相关的古北区茎蜂。本研究利用公开可得的Illumina测序reads重建了其线粒体基因组，并与近缘物种的基因组织结构进
茎蜂科（Cephidae）是膜翅目中研究相对不足的类群，多个物种的线粒体基因组数据仍然有限。Cephus nigrinus是一种主要与野生禾草相关的古北区茎蜂。本研究利用公开可得的Illumina测序reads重建了其线粒体基因组，并与近缘物种的基因组织结构进行了比较。该16,782 bp序列包含线粒体典型的37个基因，并呈现涉及三个转移RNA基因位置的保守重排。与部分同属物种相比，所注释的A+T富集区相对较短，但其完整结构仍有待独立验证。系统发育分析将C. nigrinus恢复为C. pygmeus的姐妹分类单元。这些发现为茎蜂科线粒体基因组组织与进化关系提供了补充信息。
线粒体基因重排为研究膜翅目基因组进化提供了有用特征，但茎蜂科内的线粒体基因组采样仍然有限。本研究从公开可得的Illumina全基因组测序数据（SRA：SRR23907852）重建了Cephus nigrinus Thomson, 1871的线粒体基因组，并与现有茎蜂科线粒体基因组进行比较。组装序列长16,782 bp，A+T含量为81.38%，包含13个蛋白编码基因、22个转移RNA基因和2个核糖体RNA基因。在提交的注释中鉴定出长度为1295 bp的A+T富集区。比较基因顺序分析揭示，祖先线粒体IQM簇发生保守重排，其特征为nad2附近trnQ位于trnI之前，以及trnM移位至rrnS紧邻下游。基于13个蛋白编码基因、22个tRNA和2个rRNA串联数据集的系统发育分析，以强支持度将C. nigrinus与C. pygmeus恢复为姐妹分类单元。然而，在最大似然分析中，该配对相对于C. cinctus的位置获得较低支持。结果扩展了Cephinae亚科可用的线粒体基因组信息，并支持所检查Cephus物种间重排后线粒体基因组织的保守性。仍需进一步验证以确定重复控制区的完整结构。
线粒体基因组长期是研究昆虫进化关系与物种界限的重要分子资源。其组织相对紧凑、以母系遗传为主、直系同源基因含量保守且替换速率总体较高，适用于分子系统学、物种鉴定、群体遗传学和谱系地理学研究。与cox1等单个线粒体标记相比，完整线粒体基因组可提供更多系统发育信息位点，包括核苷酸组成、密码子使用、进化速率、RNA二级结构和基因顺序重排，因此比较线粒体基因组分析可提高系统发育分辨率、厘清不确定的分类关系并有助于区分近缘或形态相似昆虫。昆虫线粒体基因组通常为长约14–25 kb的双链环状分子，经典组成包括37个基因（13个蛋白编码基因、22个转移RNA基因和2个核糖体RNA基因）及一个主要非编码控制区（A+T富集区）。线粒体基因含量在昆虫中总体保守，但基因顺序可因tRNA基因易位、倒位、重复或丢失而在不同谱系间变化，这些重排可作为谱系特有或共享衍征。随着下一代测序技术发展和NCBI序列读取存档（SRA）等公共原始数据增加，从高通量测序数据重建线粒体基因组成为可能，但膜翅目各谱系线粒体基因组代表性不均，尤其在传统并系的广腰亚目（Symphyta）中采样不足。
茎蜂科相对于其形态和生态多样性而言研究仍较不足。Cephus属物种分布于古北区和新北区，其中C. cinctus、C. pygmeus等具有农业重要性，其内生幼虫在禾草和谷类作物茎内发育，导致茎秆弱化、倒伏和减产。C. nigrinus Thomson, 1871亦见于区域区系研究。此前首个完整茎蜂科线粒体基因组（新北区小麦茎蜂C. cinctus）已揭示相对于祖先昆虫基因顺序的衍生tRNA位置；随后对古北区Cephini的研究显示共享的线粒体特征，包括IQM簇重排、膜翅目中未见报道的rrnS异常延长以及A+T富集区的广泛串联重复扩张；Cephinae亚科更广泛采样进一步表明IQM重排为该亚科共有衍征，重排亦影响trnT–trnP簇，并出现节肢动物中罕见、此前在其他广腰亚目中未知的tRNA重复事件。然而，Cephidae多个谱系（尤其Cephini以外）线粒体基因组信息仍有限，部分已提交序列在末端和非编码区不完整，限制了对总基因组长度和控制区结构的直接比较。C. nigrinus线粒体基因组为研究属内保守基因排列和序列变异提供了额外数据集。
研究人员利用NCBI SRA中公开的Illumina全基因组测序reads（SRR23907852）重建并注释了C. nigrinus线粒体基因组，表征其基因含量、核苷酸组成、密码子使用和基因组织，重点分析Cephinae中已报道的IQM相关重排，并比较C. nigrinus、C. cinctus、C. pygmeus和C. sareptanus的基因排列；同时基于13个蛋白编码基因、22个tRNA和2个rRNA的串联数据集开展系统发育分析。结果显示，组装序列长16,782 bp，含37个线粒体基因，A+T含量81.38%，注释A+T富集区1295 bp；基因排列与祖先昆虫顺序不同，trnQ位于nad2附近trnI之前，trnM位于rrnS紧邻下游、A+T富集区上游；四种Cephus的比较支持该衍生排列的保守性；最大似然法和贝叶斯推断均以强支持恢复C. nigrinus与C. pygmeus为姐妹分类单元，但二者相对于C. cinctus的位置在最大似然分析中支持较弱。该研究扩展了Cephinae线粒体基因组资源，并表明利用现有基因组数据扩展比较分类学资源的价值。
关键技术方法：研究人员从NCBI SRA获取C. nigrinus公开Illumina HiSeq X Five 150 bp双端测序数据（SRR23907852；BioProject PRJNA809169；BioSample SAMN28561985，约6930万读对），使用Trimmomatic v0.39进行质量与接头修剪，以BBMap v38.90参考引导比对（参考C. pygmeus线粒体基因组KM377623）识别线粒体reads，采用SPAdes进行从头组装，并以BWA-MEM v0.7.17回贴组装序列、SAMtools计算测序深度；使用MITOS2（无脊椎动物线粒体遗传密码，NCBI遗传密码5）注释并在Geneious Prime中核查基因边界，tRNA二级结构由MITOS2预测；以AT-skew和GC-skew评估核苷酸组成与链不对称性，以MEGA X计算相对同义密码子使用（RSCU）；比较基因顺序分析使用GenBank中C. cinctus（FJ478173）、C. pygmeus（KM377623）和C. sareptanus（KM377624）注释记录；系统发育分析纳入17个分类单元（外群Cladiucha punctata，NC_062838），蛋白编码基因采用氨基酸引导比对，tRNA和rRNA用MAFFT v7比对，SequenceMatrix v1.7.8串联获得16,619个比对位点，PartitionFinder v2确定6个分区方案，MrBayes v3.2.7进行贝叶斯推断（BI），IQ-TREE v1.6.12进行最大似然（ML）分析（ModelFinder选择GTR+F+I+G4，1000次超快自举和SH-aLRT检验），并以Tracer v1.7评估收敛，另开展替换饱和与核苷酸组成异质性探索性分析及仅用第一、第二密码子位置的敏感性分析。
研究结果：组装与注释方面，从头组装获得的C. nigrinus线粒体序列长16,782 bp，含13个蛋白编码基因（PCGs）、22个转移RNA基因（tRNAs）和2个核糖体RNA基因（rRNAs）；依据GenBank注释（BK071385），23个基因位于正（+）链、14个位于负（?）链，并注释1295 bp的A+T富集区。回贴分析显示平均测序深度6219.26×、中位深度6047.5×，全部16,782个位点均被覆盖且无模糊核苷酸，线性化组装末端（尤其A+T富集区附近）出现覆盖度高峰，但其确切来源无法仅由深度确定。
基因组织与比较分析方面，C. nigrinus线粒体基因排列不同于假定祖先昆虫组织，主要涉及祖先IQM簇相关tRNA基因位置：trnQ位于nad2附近trnI之前，trnM位于rrnS紧邻下游和A+T富集区上游。四种Cephus比较显示蛋白编码基因和核糖体RNA基因排列保守；C. nigrinus、C. cinctus和C. pygmeus均具相同IQM相关重排，C. sareptanus现有序列缺少含trnQ和trnI的区域而无法直接评估该部分，但trnM亦注释于rrnS下游，支持所检查Cephus物种间重排基因组织的保守性，比较受末端序列不完整限制。
核苷酸组成与密码子使用方面，线粒体序列呈显著A+T偏倚，总体A+T含量81.38%，PCG第三密码子位置A+T含量最高（90.15%），PCGs合计A+T含量78.53%；RSCU分析显示偏好A和U富集同义密码子，UUA（Leu）RSCU值最高（4.64），其次为CGA（Arg；2.80）和UCA（Ser；2.76），而绝对计数最多的密码子为AUU（Ile；415次）和UUA（Leu；404次），区分了相对同义密码子偏好与绝对密码子频率。13个PCGs合计长度11,121 bp。
系统发育分析方面，基于17个分类单元、16,619个比对位点的串联线粒体数据集，ML和BI分析均恢复C. nigrinus与C. pygmeus为姐妹分类单元，ML超快自举支持度100、BI后验概率1.00；但该配对相对于C. cinctus的位置支持较弱（ML超快自举60，BI后验概率1.00），提示所检查Cephus物种间更深层关系应谨慎解释。探索性分析显示第三密码子位置替换饱和程度高于第一、第二位置，配对序列对称性检验提示数据集存在组成异质性；排除第三密码子位置的补充ML分析未能清晰解析Cephus内弱支持深层关系，表明解释线粒体系统发育关系时应考虑替换饱和与组成异质性。
讨论部分总结：研究人员比较了四条Cephus线粒体序列长度（C. cinctus 19,339 bp、C. nigrinus 16,782 bp、C. pygmeus 16,145 bp、C. sareptanus 15,212 bp），但指出C. pygmeus和C. sareptanus记录为不完整序列，其长度不应解释为完整线粒体基因组大小；三者注释A+T富集区长度分别为3873 bp、1295 bp和646 bp，短读长组装可能未完全解析串联重复，故C. nigrinus的1295 bp A+T富集区完整重复结构和环化连接点仍需独立验证。IQM相关重排与Cephinae既往报道一致，但现有比较数据未确定精确分子机制或重排事件数目，其他Cephinae中报道的trnT–trnP簇重排和tRNA重复未在C. nigrinus注释中识别。注释rrnS长987 bp，与近缘类群中相对延长的rrnS一致，但未专门研究C. pygmeus和C. sareptanus中报道的rrnS结构域I和II插入在C. nigrinus中的存在、位置和结构对应性。核苷酸组成和链不对称性与其他茎蜂科及广腰亚目线粒体基因组报道模式总体一致，但组成和同义密码子使用本身不提供松弛纯化选择或适应性进化的直接证据，故未就选择强度或方向作结论；Cephini中报道的平行氨基酸替换未在本研究专门检验。系统发育方面，C. nigrinus–C. pygmeus姐妹关系在ML和BI中均获强支持，而其相对于C. cinctus的位置在ML中支持较低，尽管BI后验概率为1.00，该差异表明更深层关系不宜视为已明确解决；敏感性分析未消除深层关系的不确定性，因此姐妹群关系比其余同属物种的精确分支顺序更可靠，未来需扩大分类单元采样、增加独立分子标记并采用更好处理组成异质性的模型。研究人员指出，基因组织与既往比较研究一致，tRNA重排为Cephinae内保守结构特征，IQM相关重排在多个所检查cephine谱系中似为共享，而蛋白编码和核糖体RNA基因总体排列相对稳定，但现有线粒体基因组尚不能完全确定这些重排的系统发育分布，需扩大Hartigiini、Athetocephinae和Australcephinae采样。该物种亦见于区域区系调查，为解释其在茎蜂科内的系统发育位置提供背景；从公开全基因组reads重建C. nigrinus线粒体序列也证明现有基因组数据对扩展比较分类学资源的价值。
结论翻译：利用公开Illumina测序数据重建的C. nigrinus线粒体基因组组装为茎蜂科比较线粒体基因组研究提供了额外资源。该16,782 bp序列含线粒体典型的37个基因，并呈现Cephinae中既往报道的IQM相关基因重排。四种Cephus的比较分析支持该衍生排列的保守性，尤其是trnQ位于nad2附近trnI之前以及trnM移位至rrnS下游。最大似然和贝叶斯系统发育分析一致恢复C. nigrinus与C. pygmeus为姐妹分类单元，但Cephus内更深层关系在两种方法间获得不均衡支持，应谨慎解释。C. nigrinus注释的A+T富集区长度为1295 bp，但其完整重复结构和环化连接点仍有待独立验证。总体而言，这些发现扩展了Cephinae可用的线粒体基因组资源，并强调额外分类单元采样和独立组装验证对理解茎蜂科线粒体基因组进化的重要性。
