膳食共轭亚油酸对脂多糖诱导小鼠急性肝脏炎症的抗炎作用：剂量依赖性效应与最佳剂量的筛选

《Biology》：Dose-Dependent Effects of Conjugated Linoleic Acid on Hepatic Anti-Inflammatory Activity in Mice

　　

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid, CLA）具有抗炎和抗氧化生物活性，但其在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激下的最佳肝脏抗炎剂量仍不明确。本研究旨在筛选膳食CLA对LPS触发的小鼠肝脏炎症的有效剂量。将24只雄性小鼠分为四组（n = 6）：正常饮食（normal diet, ND）组、ND+0.5% CLA组、ND+1% CLA组和ND+2% CLA组。饲喂49天后，所有小鼠接受LPS注射并于24小时后处死。收集血清和肝组织检测促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、氧化应激标志物丙二醛（malondialdehyde, MDA）、抗氧化指标（超氧化物歧化酶，superoxide dismutase, SOD和总抗氧化能力，total antioxidant capacity, TAC）、肝脏炎症基因mRNA以及肝脏组织病理学。1% CLA组表现出较低的血清和肝脏促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和氧化应激标志物MDA，较高的SOD和TAC（p < 0.01），以及减少的肝脏炎症浸润。所有CLA处理均下调了肝脏CXCL1 mRNA并上调了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）mRNA（p < 0.05）。总之，在该急性LPS诱导的肝脏炎症模型中，1%膳食CLA发挥了最佳的抗炎效果，而1%和2% CLA显示出相当的抗氧化效果。本研究是一个短期急性炎症小鼠模型。未检测CLA的组织分布和脂质代谢谱，且使用了CLA混合异构体。此外，PPARγ通路仅基于mRNA水平推断，仍需进一步深入验证。

研究背景与研究目的

肝脏是机体重要的解毒和代谢器官，易受内源性和外源性有害物质攻击而发生损伤。急性肝脏炎症可迅速导致肝细胞损伤和大量炎性细胞浸润，持续的急性炎症是慢性肝损伤、肝纤维化乃至肝硬化和肝细胞癌的关键启动因素。因此，早期预防和治疗肝损伤至关重要。目前临床上虽有多种药物用于此目的，但常伴有毒副作用。相比之下，许多天然化合物如姜黄素、白藜芦醇和槲皮素等展现出保肝作用，其优势在于低毒性和多靶点调控炎症与代谢。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）作为重要的生物活性分子，可通过多种机制调节细胞炎症反应和氧化应激稳态。共轭亚油酸（conjugated linoleic acid, CLA）作为PUFAs的重要亚型，因其显著的抗炎和抗氧化活性而备受关注。CLA是亚油酸（linoleic acid, LA）的位置和几何异构体的混合物，天然来源中顺-9,反-11-CLA占80–90%，而反-10,顺-12-CLA仅占3–5%；然而体外生物转化产生的CLA通常含有相当比例的这两种异构体，因此许多研究采用两种异构体的混合物来探索CLA的生物功能。已有证据表明CLA可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ/核因子-κB（PPARγ/NF-κB）、Toll样受体4（TLR4）、环氧合酶-2（COX-2）和核因子E2相关因子2（Nrf2）等多种信号通路调节体内炎症反应和氧化应激。然而，在急性脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的肝脏炎症中，CLA的剂量依赖性效应，尤其是最佳膳食剂量，仍未完全明确。本研究旨在通过检测血清和肝脏促炎细胞因子、抗氧化指标、肝脏炎症相关基因mRNA表达及肝脏组织病理学变化，筛选膳食CLA补充对LPS诱导的急性肝脏炎症的最佳剂量，为CLA在急性内毒素触发的肝损伤中的营养预防应用提供实验依据。

研究方法

研究人员从北京军事医学科学院获取24只雄性C57BL/6J小鼠（体重：37.79 ± 2.17 g），适应性饲养7天后随机分为四组（每组n = 6）：正常饮食（normal diet, ND）组、ND+0.5% CLA组、ND+1% CLA组和ND+2% CLA组。CLA原料由青岛奥海生物有限公司提供，纯度为80.4%，其中含38.5%顺-9,反-11-CLA、38.3%反-10,顺-12-CLA和3.6%其他CLA异构体。经过49天（7周）的膳食预处理后，所有四组小鼠均接受腹腔注射LPS以建立急性肝脏炎症模型，24小时后处死并采集血液和肝脏组织。研究中使用的主要关键技术方法包括：酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清和肝脏组织匀浆上清液中促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α，TNF-α；白细胞介素-1β，IL-1β；白细胞介素-6，IL-6）的蛋白水平；生化试剂盒检测血清氧化应激标志物丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC）；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色进行肝脏组织病理学检查；实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测肝脏中TNF-α、C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）和PPARγ的mRNA丰度。

研究结果

不同CLA水平对血清炎症因子的影响：与ND组相比，CLA-0.5和CLA-1组血清IL-1β和IL-6显著降低（p < 0.05）；CLA-0.5和CLA-1组血清TNF-α也显著降低，而CLA-2组与ND组无显著差异。数据显示1% CLA膳食补充在降低LPS攻击小鼠血清促炎细胞因子方面最为有效，CLA-1组IL-1β、IL-6和TNF-α分别下降了24.95%、33.68%和35.64%。

CLA对肝脏炎症因子水平的影响：CLA-1组小鼠肝脏中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）显著降低（p < 0.01），而CLA-2组的肝脏IL-1β和TNF-α水平与ND组无显著差异且未比CLA-1组进一步降低。结果表明在饲料中添加1% CLA最有效地降低了LSP诱导的小鼠肝脏炎症，CLA-1组IL-1β、IL-6和TNF-α水平分别下降了63.52%、50.88%和68.17%。

CLA对肝脏炎症因子mRNA表达的影响：CLA-1组TNF-α基因表达显著低于ND组（p < 0.05）。所有喂食CLA的小鼠均表现出CXCL1 mRNA表达下降和PPARγ相对基因表达显著增加（p < 0.05）。

不同CLA水平对LPS攻击小鼠血清氧化应激和抗氧化指标的影响：与ND组相比，喂食CLA补充饲料的小鼠血清MDA含量显著降低，血清SOD活性和TAC显著升高（p < 0.01）。1%和2% CLA均显著提高了SOD活性和TAC，且两剂量间无显著差异。CLA-1组SOD活性和TAC分别增加了32.56%和20.03%。

组织病理学检查：显微镜检查显示，ND组肝细胞颜色较深，中央静脉周围炎性细胞较多；CLA-0.5组和CLA-2组肝细胞形态正常，中央静脉周围炎性细胞较少，肝窦细胞轻度活化但结构完整；值得注意的是，CLA-1组肝细胞形态正常，中央静脉周围炎性细胞最少，肝窦细胞结构完整，其炎症浸润程度显著低于其他组。

讨论与结论

本研究中，LPS攻击小鼠血清和肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平与细胞因子介导的肝脏炎症一致。补充CLA异构体混合物的小鼠血清和肝脏中这些促炎细胞因子水平低于ND组，且1% CLA组观察到促炎细胞因子基因转录减少，表明CLA对小鼠炎症的保护作用呈剂量依赖性。肝脏病理切片直观地显示了炎症表现，CLA-1组炎症浸润程度最低。研究人员认为CLA的抗炎特性部分由PPARs的刺激介导，PPARγ可通过与NF-κB物理相互作用抑制TNF-α和IL-6等炎症介质的产生。本研究发现CLA处理上调了肝脏PPARγ mRNA，与既往研究一致。然而，由于数据仅限于转录水平，PPARγ蛋白激活在CLA介导的肝脏保护中的因果作用仍需进一步功能实验验证。关于CLA对脂质过氧化的影响，血清MDA水平显著降低表明CLA可作为抗氧化剂。CLA通过增加细胞内谷胱甘肽等抗氧化剂和提高SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的表达来增强TAC。本研究存在若干局限性：首先，这是一个短期的LPS诱导急性炎症模型，仅评估了CLA的短期肝脏调节效应；其次，缺乏非炎症盐水注射对照组；第三，使用了混合异构体CLA制剂，无法区分两种异构体各自的贡献；第四，PPARγ的参与仅从mRNA数据推断。尽管存在这些局限，分级CLA剂量在炎症细胞因子、氧化应激标志物、组织病理学和关键基因表达方面产生了一致的剂量依赖性响应，支持了主要发现的可靠性。

结论：本研究表明，与ND组相比，补充1% CLA的饮食增强了LPS攻击小鼠的抗氧化酶活性，并显著降低了血清和肝脏中MDA及促炎细胞因子的水平。此外，CLA-1组的炎症浸润明显减少。在CLA处理的小鼠肝脏中，CXCL1 mRNA表达显著降低，而PPARγ mRNA表达显著升高。总之，研究人员的发现表明，1%膳食CLA在小鼠肝脏中发挥最有利的抗炎活性，而1%和2% CLA显示出相当的抗氧化效果。这些结论仅限于LPS触发的急性肝脏炎症模型，因为未包含盐水注射的非炎症对照组。