菊芋提取物抗金黄色葡萄球菌及其生物膜活性：基于QSAR与分子对接的潜在AgrA靶向植物化学成分鉴定

《Agronomy》：Antimicrobial and Antibiofilm Activities of Helianthus tuberosus L. Extract Against Staphylococcus aureus: Identification of Potential AgrA-Targeting Phytochemicals Using QSAR and Molecular Docking

　　

中文摘要翻译 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）仍是人类的主要病原菌，生物膜形成与抗生素耐药性使治疗更加困难。菊芋（Helianthus tuberosus L.，耶路撒冷洋蓟）是一种富含酚类化合物的植物，具有报道的抗菌活性，但其抗生物膜活性及推定的AgrA靶向成分研究甚少。本研究采用体外-计算机模拟（in vitro–in silico）整合工作流程，考察了菊芋乙醇提取物（SS-WU-1）对金黄色葡萄球菌ATCC 25923及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC 43300的作用。最低抑菌浓度（MIC）值分别为>2.250 mg/mL和1.125 mg/mL，两种菌株的最低杀菌浓度（MBC）值均为>2.250 mg/mL。亚抑菌浓度处理在1/2× MIC条件下显著抑制MRSA生物膜形成，抑制率达96.6 ± 0.5%。扫描电子显微镜显示细菌覆盖减少、细胞分散度增加及生物膜结构改变。UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析共获得677个初步注释的分子特征（ESI+模式481个，ESI?模式196个）。基于15个经实验表征的AgrA抑制剂构建的多元线性回归QSAR模型显示出良好的拟合度（R2 = 0.8749；Q2LOOCV = 0.7017）。虚拟筛选与适用域评估优先筛选出P273、P385和P348进行针对AgrA LytTR结构域的分子对接。这些化合物代表了可供实验验证的计算优先候选物。在不伴随生长抑制的情况下抑制生物膜形成，提示其具有潜在的抗毒力效应，与器械相关感染的预防相关。因此，SS-WU-1是进一步研究抗生物膜植物化学成分的潜在来源，但AgrA的可能参与仍属假设，有待实验验证。

论文解读

一、研究背景与意义

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是严重威胁人类健康的病原菌，可引起从轻度皮肤软组织感染到致命性侵袭性疾病的多种感染类型。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和传播使治疗选择日益受限。然而，问题的复杂性不仅在于抗生素耐药性——该菌还能动态调控毒力、应对宿主应激并产生生物膜，使其能够在抗菌治疗和宿主免疫应答中存活。传统抗生素疗法以杀灭细菌生长为目标，但并未针对那些使金黄色葡萄球菌得以持续存在和致病的调控回路。因此，靶向细菌毒力及其调控网络已成为治疗金黄色葡萄球菌感染的有前景的补充策略。

附属基因调节子（agr）群体感应（QS）系统是金黄色葡萄球菌毒力的主调控因子，根据细菌群体密度调节毒力相关基因的表达。agr 位点内两个方向相反的启动子P2和P3发挥关键作用：P2操纵子编码AgrBDCA，负责合成、加工、输出和感知自诱导肽（AIP）；在高细胞密度下，AIP诱导膜结合传感器组氨酸激酶AgrC磷酸化，进而磷酸化反应调节因子AgrA。AgrA的C端LytTR DNA结合结构域结合P2和P3启动子区域，形成正反馈回路并增强RNAIII的转录，从而调控多种毒力相关基因及细胞表面分子的表达。因此，干扰AgrA介导的转录可能成为减弱金黄色葡萄球菌毒力特征的途径。

AgrA的C端LytTR DNA结合结构域因其结构独特的DNA结合界面而成为小分子发现的理想靶点。该结构域采用延伸的β折叠构象，通过环区而非传统的螺旋-转角-螺旋基序识别DNA。其中His169和Arg233残基参与直接的碱基特异性DNA接触，Asn201通过水介导的相互作用参与识别；这些残基的突变会显著损害AgrA-DNA结合。氟灭酸（Flufenamic acid）已被证明能抑制AgrA依赖性转录并干扰AgrA-DNA结合；Savirin、hispidulin、azan-7和physalin H等药物也被证实与AgrA相关信号传导或AgrA-DNA相互作用有关。这些结果共同表明AgrA是抗毒力导向药物发现中具有药理学可及性的靶点。

植物来源代谢物为抗菌、抗生物膜和毒力靶向药物发现提供了化学多样性支架，其芳香环、氢键基团和疏水取代基等结构特征可促进与调控蛋白的相互作用。已有多种植物来源化合物被报道可干扰agr系统。然而，将实验抗菌/抗生物膜评价与植物来源化合物靶向AgrA的计算优先化相结合的系统性工作流程仍然有限。定量构效关系（QSAR）建模提供了一种基于配体的策略，可将分子结构与生物活性关联起来，并从化学多样性文库中快速优先化化合物；分子对接则评估与特定蛋白靶点的潜在相互作用。这些方法虽不能确定靶点抑制，但其整合可产生可检验的机制假说，同时缩小后续实验验证的化学空间。

菊芋（Helianthus tuberosus L.，cv. Kaen Tawan）是菊科作物，含有酚类、黄酮类、香豆素类及相关芳香族化合物等多种次级代谢产物。这种化学多样性使菊芋成为抗菌和抗生物膜研究以及金黄色葡萄球菌毒力靶向研究的理想来源。本研究采用体外-计算机模拟整合方法，考察菊芋乙醇提取物（SS-WU-1）对金黄色葡萄球菌ATCC 25923和MRSA ATCC 43300的抗菌和抗生物膜活性，并鉴定具有潜在AgrA靶向活性的植物化学成分。

二、主要技术方法

研究人员采用了整合的体外实验与计算机模拟工作流程。体外实验方面，采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），通过亚培养法测定最低杀菌浓度（MBC），采用结晶紫微量滴定板法评价生物膜抑制活性，并使用扫描电子显微镜（SEM）观察处理后的生物膜结构和细胞形态变化。化学成分分析采用超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS）在正负离子双模式下对提取物进行植物化学分析。计算机模拟方面，从ChEMBL数据库获取15个经实验确认的AgrA抑制剂构建数据集，采用密度泛函理论（DFT）进行几何优化，使用Dragon 5.5和内部脚本计算分子描述符和量子化学描述符，通过双重（嵌套）交叉验证方法开发多元线性回归（MLR）QSAR模型，利用Williams图评估适用域，采用AutoDock Vina 1.2.7进行分子对接，并使用SwissADME和ProTox-3.0进行ADME和毒性预测。植物材料采集自泰国暖武里府Kasiwatthana农场，菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923和MRSA ATCC 43300。

三、研究结果

3.1 菊芋提取物对金黄色葡萄球菌具有抗菌和抗生物膜活性

SS-WU-1对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的直接抗菌活性较弱，MIC和MBC均>2.250 mg/mL；对MRSA ATCC 43300的MIC为1.125 mg/mL，MBC>2.250 mg/mL，MBC/MIC比值>2.0，不能明确判定为杀菌剂。然而，SS-WU-1对两种菌株均表现出明显的抗生物膜活性。对MRSA ATCC 43300，在1/2×、1/4×和1/8× MIC（分别为0.563、0.281和0.141 mg/mL）条件下，生物膜抑制率分别达96.6 ± 0.5%、80.5 ± 1.6%和54.4 ± 4.6%，所有浓度均显著抑制生物膜形成。值得注意的是，即使在1/8× MIC的显著亚抑菌浓度下仍保留54.4 ± 4.6%的抑制率。对ATCC 25923，在2.250、1.125和0.563 mg/mL浓度下，生物膜抑制率分别为14.43 ± 4.86%、7.07 ± 3.36%和5.55 ± 1.80%。在相同孔中监测浮游生长发现，在1/2× MIC条件下生物膜形成被抑制96.6 ± 0.5%时，浮游生长基本不受影响（ΔOD₆₀₀值与对照无显著差异），表明观察到的抗生物膜活性不能仅归因于生长抑制。

3.2 SS-WU-1改变生物膜结构和细胞形态

SEM分析显示，未经处理的两种菌株均呈现密集的细菌群体，细胞形态完整、光滑、球形，细胞间相互作用显著。经SS-WU-1处理后，两种菌株均出现细菌密度逐渐降低和生物膜结构改变，MRSA中的效果更为明显。处理组细菌覆盖减少、细胞簇分离度增加，较高剂量处理还导致细胞表面不规则性增加和聚集减少。MRSA中观察到更显著的结构改变，包括细菌覆盖大幅减少、细胞分散度增加和细菌结构瓦解。但大多数细胞仍保持球形，未观察到明显的细胞破裂或完整性丧失，表明这些变化主要是生物膜结构和表面形态的改变，而非直接的杀菌性膜破坏。

3.3 UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS植物化学分析

双模式UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析共获得677个初步注释的分子特征，其中ESI+模式481个，ESI?模式196个。ESI+模式中代表性的酚类注释包括大豆苷元、东莨菪内酯、野黄芩素、异秦皮素和异阿魏酸；ESI?模式中检测到咖啡酸、肉桂酸、对香豆酸和奎尼酸等相关注释。这些化合物基于精确质量和/或MS/MS谱图匹配进行初步归属，未经与标准品对照确认。检测到包括类黄酮和香豆素相关代谢物在内的多种酚类物质，为后续基于QSAR的虚拟筛选和分子对接提供了化学基础。

3.4 QSAR模型与AgrA抑制剂虚拟筛选

基于15个AgrA抑制剂的QSAR模型开发中，嵌套交叉验证产生的Q2_nested为0.2770，RMSE_nested为0.8264，MAE_nested为0.5634，表明整体建模流程的预测性能适中。最终模型包含三个描述符：1st component symmetry directional WHIM index/weighted by polarizability（G1p）、Harmonic Oscillator Model of Aromaticity index（HOMA）和R maximal autocorrelation of lag 7/weighted by van der Waals volume（R7v+）。最终模型R2为0.8749，调整R2为0.8407，RMSE为0.3438，MAE为0.2488；LOOCV的Q2_LOOCV为0.7017，RMSE_LOOCV为0.5309，MAE_LOOCV为0.3699。Y-scrambling验证中，100次随机排列产生的R2和Q2_LOOCV值均显著低于原始模型，表明模型性能不太可能源于偶然相关。所有15个训练化合物均位于适用域内。将模型应用于677个植物化学成分后，以预测pIC₅₀≥6.0为阈值初步筛选出41个化合物；经适用域评估后，13个化合物位于模型适用域内，其中P273预测pIC₅₀值最高（6.83），其次为P385（6.73）和P348（6.52），这三个化合物被选用于分子对接分析。

3.5 QSAR优先化合物的AgrA结合模式

分子对接结果显示，P348的Vina评分最优（?7.237 kcal/mol），其次为P273（?6.377 kcal/mol）和P385（?4.401 kcal/mol），参考配体氟灭酸（FFA）为?6.078 kcal/mol。P273主要与Ser165、His169、Arg170、Leu186、Lys187和Asn201形成极性接触网络，其嘌呤酮羰基与Leu186骨架形成氢键注释（2.80 ?），外环氨基向Asn201侧链羰基供氢（3.37 ?）。P385采取延伸构象，末端醇羟基与Ser165、His169和Arg170骨架形成极性接触，烃链与Leu171和Leu186形成疏水相互作用。P348的保留构象（mode-1）占据远离天然DNA位置的表面区域，与Glu144骨架N-H形成氢键注释（2.90 ?），疏水注释涉及Ile143、Glu144、Tyr153和Phe182，距最近天然DNA重原子9.01 ?；其替代构象（mode-3）接近DNA朝向表面，评分为?7.194 kcal/mol。FFA占据不同表面区域，涉及Asp176、Asn177、Arg178的氢键注释及Val152、Val154、Leu175、Asn177和Ile180的疏水注释。P273和P385的构象包含与His169的注释接触，P273还与Asn201有接触，提示这些化合物可能作用于DNA结合表面。

3.6 预测ADME、类药性和毒性特征

P273分子量为283.24 g/mol，consensus LogP为?2.12，TPSA为159.51 ?2，预测胃肠道（GI）吸收低，LD₅₀为13 mg/kg（毒性类别2），预测对神经毒性、肾毒性、呼吸毒性和临床毒性呈活性。P385分子量最低（154.25 g/mol），consensus LogP为2.82，TPSA为20.23 ?2，预测GI吸收高，LD₅₀为2100 mg/kg（毒性类别5），所列毒性终点均预测为无活性。P348分子量为380.37 g/mol，consensus LogP为1.58，TPSA为82.06 ?2，预测GI吸收高且可透过血脑屏障（BBB），LD₅₀为1000 mg/kg（毒性类别4），预测神经毒性、呼吸毒性和临床毒性呈活性。三个化合物均预测为非P-糖蛋白（P-gp）底物，生物利用度评分均为0.55，均无Lipinski规则违例和PAINS警报。

四、讨论与结论

讨论部分指出，SS-WU-1表现出菌株依赖性抗菌活性，对MRSA显示出更强的抗生物膜效果。在亚抑菌浓度下抑制生物膜形成而不伴随浮游生长减少，支持抗毒力视角。然而，agr在生物膜形成中的作用具有菌株和条件依赖性，观察到的表型不能直接指示AgrA抑制，但为将AgrA作为潜在调控靶点提供了依据。QSAR模型的嵌套交叉验证性能适中，反映了有限样本量和结构多样性带来的限制，但正向的Q2_nested表明建模流程保留了部分预测信息，可作为初步虚拟筛选框架。分子对接结果提供了结构假说，但对接分数是计算估计值而非实验确定的结合亲和力，不能证明直接结合或抑制活性。ADME和毒性预测为候选化合物优先化提供了初步信息，但均需实验验证。

研究结论为：菊芋乙醇提取物在测试条件下以亚抑菌浓度抑制MRSA生物膜形成，且不伴随浮游生长的统计学显著降低。这些发现提示潜在的抗生物膜效应，但潜在机制尚待确定。化学分析和计算分析优先筛选出三个初步注释的植物化学候选物P273、P385和P348供进一步研究。然而，与AgrA的预测相互作用并不能确定直接结合、AgrA抑制或所观察到的抗生物膜效应对agr群体感应通路的依赖性。未来研究应确认这些化合物的身份，实验评估其生物活性，并研究提出的机制。还应使用更多临床分离株和独立制备的提取物批次评估这些发现的重复性。