基于动力学建模的植物乳植杆菌DHCU 70发酵珍珠粟合生元及后生元微珠的胃肠道耐受性与结肠存活能力

《Fermentation》：Kinetic-Modelled Synbiotic and Postbiotic Microbeads from L. plantarum DHCU 70 Fermented Pearl Millet Show Gastrointestinal Resilience and Colonic Viability

　　

珍珠粟（Pennisetum glaucum）经植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）DHCU 70发酵，以构建用于微生物包埋的谷物基基质。研究人员将重新参数化的改良Logistic模型拟合于活细胞生长数据，以确定与高细胞密度及发酵代谢物积累相关的发酵收获区间。基于复合意愿度分析，意愿度在17.5 h达到最大，并在17至22 h维持平台期（D ≥ 0.97）；在其平台期内选取18.0至20.5 h的收获区间，在此期间活菌数达9.15至9.25 log CFU mL^?1，总测定有机酸为27.9至28.7 g L^?1（17.5 h时最大值为29.9 g L^?1）。所选发酵基质含有活细胞、残余可溶性碳水化合物组分及发酵来源成分，将其并入直径为0.8至1.2 mm的海藻酸钙-明胶微珠中。该微珠配方在包埋过程中对活细胞及测定的发酵来源成分表现出高保留率。在序贯模拟口腔、胃及肠道条件下，海藻酸钙-粟米-明胶配方保留6.45 log CFU mL^?1，而游离细胞为3.45 log CFU mL^?1，表明包埋细胞活力损失更低。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，包埋后与碳水化合物相关的特征性羟基、羧酸根及光谱谱带得以保留。相对于未包埋的发酵基质，微珠在所应用的体外试验中表现出降低的淀粉水解。冻干微珠的水分活度为0.40 ± 0.02，吸湿性为56 ± 2.26%，10 min后复水率为71.66 ± 26.30%。包埋收获时间的选择以发酵动力学及发酵基质的代谢物谱为指导。所得海藻酸盐-明胶微珠在受试模拟胃肠道条件下较游离细胞提高了植物乳植杆菌DHCU 70的存活率。该配方为发酵功能性食品递送系统的进一步开发提供了谷物基平台。

研究背景：全球益生菌市场规模达950亿美元，消费者对肠道健康及消化、免疫相关疾病的关注持续上升。研究人员提出"gerobiotics"概念，指靶向基本衰老过程并支持宿主健康寿命的特定益生菌菌株及其衍生物。既往研究报道，经植物乳植杆菌DHCU 70发酵珍珠粟饮料处理的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）第24天存活率为34.17%、第28天为13.33%，而M9对照组分别为20%和0%。益生菌的治疗效力关键取决于益生元——可被宿主微生物选择性利用的底物（如寡糖），其选择性刺激益生菌增殖与代谢，产生包括短链脂肪酸（SCFAs）、肽和有机酸在内的后生元。后生元术语沿两套框架发展，ISAPP定义强调含无生命微生物和/或其细胞组分的益生物配方，而更广泛的文献用法涵盖生物活性微生物产物（包括发酵来源代谢物）。本研究中"后生元代谢物"采用后生元概念更广泛、包含代谢物的用法，涵盖短链脂肪酸和无细胞上清等类别。它们作为宿主-微生物对话的主要分子介质，通过G蛋白偶联受体激活和表观遗传调控，经肠-脑、肠-肝和肠-免疫轴对远端器官发挥作用。生产、加工和配方胁迫可影响益生菌活力及可培养细胞回收，需要适合产品基质的活力测定方法；现有递送方式难以向远端肠道递送所需益生菌阈值（≥10⁶–10⁷ CFU/g）以实现定植。合生元配方将活微生物与可利用底物结合以赋予宿主健康益处，共包埋还可将微生物代谢物纳入递送系统。现有包埋技术中，海藻酸钙微珠多孔网络成本低、经离子otropic凝胶化易于成型，但允许胃酸和胆盐快速进入，导致代谢物过早释放和上消化道转运中益生菌大幅对数级损失，此局限与累积质子及驻留细菌群体浓度依赖性增大凝胶孔径直接相关。壳聚糖、κ-卡拉胶或植物胶等次级壁材可限制孔径并增强机械完整性，但常增加微珠直径并促进颗粒聚集。Premjit等（2024）证明海藻酸钙-κ-卡拉胶微珠包埋的嗜热链球菌胃肠道保护及肠道释放改善。围绕营养惰性培养基配制微珠且后生元代谢物既未定量也未刻意截留于基质中构成另一重要局限；发酵终点按惯例而非机理动力学建模选择，导致包埋时活细胞、残余碳水化合物和有机酸载量不一致。水分活度、吸湿性和复水动力学等直接决定货架期和终端使用性能的属性在多数益生菌微珠系统中关注有限。在刻意的"益生元-益生菌-后生元"框架内进一步整合气候韧性全谷物载体在文献中基本未涉及。因此本研究旨在以植物乳植杆菌DHCU 70发酵珍珠粟开发综合的益生元-益生菌-后生元基质，采用重新参数化改良Logistic模型和多层海藻酸钙-明胶包埋，以确保胃肠道耐受性和靶向大肠递送，同时保持后生元完整性。

研究人员开展的研究与结论：研究以认证农户采购的珍珠粟粉（蛋白质13.65 ± 2.13%，膳食纤维9.12 ± 3.41%）为原料，经发酵动力学建模、合生元核心悬液制备、海藻酸钙微珠成型、包埋效率与载量测定、包埋后抗酶解与酸水解评估、FTIR后生元潜力分析、微珠理化表征（形态与粒径、水分活度与吸湿性、热行为）、INFOGEST 2.0体外胃肠道模拟及复水动力学等系统研究。结论表明：以发酵动力学和代谢物谱指导包埋收获时间选择；所得海藻酸盐-明胶微珠在受试模拟胃肠道条件下较游离细胞提高了植物乳植杆菌DHCU 70的存活率；该配方为发酵功能性食品递送系统的进一步开发提供了谷物基平台。重要意义在于将发酵动力学与包埋设计整合，建立了稳健、可规模化的合生元食品配方，增强益生元、益生菌和后生元的靶向递送，并支持将未充分利用的粟米作为可持续、营养敏感食品系统中的高值功能基质。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用重新参数化改良Logistic模型拟合活细胞生长曲线并以复合意愿度函数优化收获区间；以植物乳植杆菌DHCU 70发酵珍珠粟制备含活细胞、残余可溶性碳水化合物及发酵代谢物的合生元核心；经挤压滴入CaCl₂溶液进行海藻酸钙离子otropic凝胶化并以明胶二次包覆构建双层微珠；采用HPLC测定有机酸、DNS法与蒽酮法测定糖、Folin-Ciocalteu法与氯化铝比色法测定总酚与总黄酮；采用FTIR、DSC、水分活度与吸湿性测定及粒径分析表征微珠；采用基于INFOGEST 2.0的静态体外消化模型评估胃肠道存活与靶向递送；采用一阶模型拟合复水动力学；统计分析采用双因素/单因素方差分析结合Tukey HSD或DMRT检验。珍珠粟粉来源于印度Mysuru认证农户。

研究结果：

3.1 发酵动力学：珍珠粟浆经植物乳植杆菌DHCU 70发酵24 h呈现底物饱和动力学，生长、酸化与代谢物积累轨迹汇聚界定适合合生元包埋的晚对数期收获点。3.1.1 微生物生长动力学：活细胞呈S形生长曲线，0至4 h为适应期，约4至12 h快速生长，约18 h后接近稳定期；活菌数从接种时6.00 log CFU/mL增至20.5 h时最大观测值9.25 log CFU/mL，21 h后轻微下降（可能与底物耗尽、有机酸积累和/或低pH胁迫有关，但本实验未区分这些可能机制）。重新参数化改良Logistic模型紧密描述实测生长轨迹，R² > 0.98。3.1.2 理化变化与底物利用：pH从起始5.50降至17.5 h的4.43，并维持近4.5至24 h终点，与乳酸发酵酸化及总测定有机酸增加一致；还原糖从17.54 mg/L降至约20 h时接近分析检测或定量限，总可溶性糖呈相似下降趋势，表明发酵期间测定的可溶性糖大量消耗；总测定有机酸在初始适应期后增加，17.5 h达29.9 g/L，24 h略降至27.3 g/L，活细胞浓度上升与有机酸产生的时间重叠与生长关联型代谢物形成一致；发酵使总酚含量（TPC）从13.38增至54.60 mg GAE/L，最高增幅出现在前12 h，随后呈稳定晚期发酵谱；总黄酮含量（TFC）从13.01增至28.50 mg QE/L，在发酵后期接近平台。3.1.3 收获时间选择：结合活细胞浓度、总测定有机酸和残余糖浓度的加权意愿度函数分析表明适宜收获区间为18.0至20.5 h；复合意愿度指数在指数生长期陡升，17.5 h达最大（D = 0.98），并在17–22 h维持D = 0.97至0.98的平台；在该平台内选择18.0–20.5 h区间，因总测定有机酸已过最大值（29.9 g L^?1）并稳定（27.9–28.7 g L^?1），还原糖处于检测限，活菌数在观测最大值0.11 log范围内（9.15至9.25 log CFU mL^?1），且22 h后活力下降尚未开始；意愿度函数框架为将多个过程响应转化为单一复合准则以同时优化提供了实用方法。

3.2 海藻酸钙微珠在不同收获时间维持高包埋效率：植物乳植杆菌DHCU 70包埋效率6 h为90.10%，24 h降至74.30%，72 h降至50.30%；后生元包埋效率6 h为92.90%，24 h降至61.10%，72 h降至43.60%。微珠保留9.30 × 10⁸ CFU/g和10.54 g/L代谢物，超过EFSA货架期末最低阈值10⁶ CFU/g，同时在峰值浓度捕获代谢物。单因素方差分析证实收获时间对包埋效率有显著影响（F_4,10 = 12.34，p < 0.001）。

3.3 包埋降低酶促淀粉水解，保留碳水化合物用于靶向递送：所有时间点上，唾液淀粉酶对包埋前浆料的水解活性从0至12 h的1.79 ± 0.02%增至3.86 ± 0.01%，而对包埋微珠的活性低得多（0.09 ± 0.02%至0.74 ± 0.04%），表明微珠形成降低淀粉水解，使更大比例碳水化合物逃逸口腔消化；胰腺淀粉酶呈相似趋势，包埋前活性从1.65 ± 0.03%升至3.72 ± 0.06%，包埋后值维持在0.16 ± 0.03%至0.81 ± 0.02%，证实海藻酸盐基质有效屏蔽底物免受小肠淀粉水解；非包埋系统胃pH从1.98 ± 0.03升至12 h的2.96 ± 0.06，显示可溶性可发酵组分的渐进缓冲，而包埋基质缓冲贡献较小，与可溶性缓冲组分从微珠中有限释放（0.76 ± 0.06至0.65 ± 0.03）一致，表明多数酸不稳定和可发酵组分保留在微珠核心内；这些结果表明海藻酸盐微珠保护可发酵碳水化合物免受上消化道消化，保留其用于靶向递送。

3.4 明胶-海藻酸钙网络在贮藏期间稳定后生元功能基团：FTIR光谱分析证实短链脂肪酸、肽和海藻酸钙连接的存在；包埋前光谱（Δt = 0 h）显示约3300–3400 cm^?1宽O-H伸缩带（归因于海藻酸盐和多糖羟基）、约1630–1650 cm^?1（COO^?不对称伸缩）和1420–1450 cm^?1（COO^?对称伸缩）明显羧酸根带，以及约1650至1540 cm^?1间多个峰（归因于肽酰胺I/II振动）；1150–1000 cm^?1区域谱带与粟米碳水化合物和胞外多糖的糖苷键相关，低于1000 cm^?1信号反映Ca²⁺-海藻酸盐交联和骨架C-O-C模式；包埋后光谱显示约3008、2921和2852 cm^?1谱带，分别归因于不饱和和脂肪族C-H振动；约1744 cm^?1明显特征归因于酯化和/或羧基的羰基伸缩，1680–1023 cm^?1区域内变化表明羰基和多糖化合物修饰；包埋和贮藏后特征性羟基、羧酸根、酰胺和糖苷键谱带的保留表明基质主要功能基团无总体变化，与其主要成分的保持一致。

3.5 微珠理化表征：3.5.1 形态与粒径：显微镜显示海藻酸钙-粟米-明胶微珠为表面光滑的均匀球体，平均直径0.8–1.2 mm；横截面显示明显三层结构，即最外层明胶壳（约100 μm厚，提供光滑蛋白质包衣）、中间海藻酸钙离子增强层（约50 μm）和内部均匀发酵粟米核心，界面清晰无分层；海藻酸钙-明胶双壳增强明胶的成膜和生物黏附性能以实现初始保护，并由海藻酸盐的pH敏感性强化以实现控释靶向释放；这与研究中模拟结肠条件后高活力（6.45 log CFU/mL）相对应，并定位于需要表面黏附和定时载荷递送的应用。3.5.2 水分活度与吸湿性：对照粉水分活度高（0.95 ± 0.03），易受微生物生长和快速品质损失影响；掺入粟米基质使a_w降至0.61 ± 0.17，海藻酸钙-粟米基质和海藻酸钙-粟米-明胶基质进一步分别降至0.54 ± 0.02和0.40 ± 0.02；加明胶微珠处于干燥益生菌粉典型稳定性窗口（a_w 0.3–0.4）内，支持长期活力和氧化稳定性；吸湿性呈相反模式，对照和粟米基质粉高度 moisture敏感（67 ± 0.24%和82 ± 3.45%），海藻酸钙-粟米基质最低（34 ± 1.42%），海藻酸钙-粟米-明胶基质居中（56 ± 2.26%）；海藻酸钙微珠吸湿性降低表明基质更不亲水、更致密、吸收环境水分更少，这对合生元粉的环境贮藏有利。3.5.3 热行为：对照显示吸热转变（起始55.66 °C，峰值71.05 °C，终止84.77 °C；ΔH = 10.0643 J/g），证实淀粉糊化、蛋白质变性和结合水释放，较高焓值表明主要受支链淀粉双螺旋和氢键影响的结晶构型；植物乳植杆菌发酵（9 h）使转变移至较低温度，伴随焓值降低和峰变宽，表明淀粉和蛋白质的酶促降解、酸化导致氢键破坏及无定形性增强；海藻酸钙包埋提高转变温度（起始78.77 °C，峰值82.63 °C，终止89.35 °C；ΔH = 9.6915 J/g），表明Ca²⁺离子交联、分子迁移受限和水截留增强热稳定性；将明胶掺入海藻酸盐基质提高转变温度并加宽峰，表明通过蛋白质-多糖-氢键和静电相互作用形成厚互穿网络。

3.6 多层微珠增强益生菌胃肠道存活与靶向递送：所有配方在模拟唾液液（SSF）后起始为10.0 log CFU/mL；游离细胞在模拟肠液（SIF）中急剧降至3.45 log CFU/mL，而普通粟米基质保留4.55 log CFU/mL；海藻酸钙粟米微珠（Ca-Al–Mil-Matrix）在SIF中存活提高至5.7 log CFU/mL，但优化的海藻酸钙-粟米-明胶基质（Ca-Al–Mil–Gel-Matrix）实现靶向递送，模拟结肠转运后剩余6.45 log CFU/mL（>10⁶ CFU/mL），满足EFSA活力标准；从胃到盲肠的渐进保护（7.85至6.45 log CFU/mL）表明pH和酶触发释放，直至靶位点载荷损失最小。

3.7 复水动力学：海藻酸钙-粟米-明胶基质微珠在Δt 10 min时复水率更快，为71.66 ± 6.30%，其他组平均为51.00 ± 4.17%；其逐步加快的复水可归因于分级孔隙率和亲水明胶-海藻酸盐壳促进毛细管进入和受控溶胀；这为产品增添"速溶"消费者便利性，同时保持先前观察到的胃肠道保护（盲肠6.45 log CFU/mL）和贮藏稳定性（a_w = 0.40），使该系统对靶向模拟结肠递送的合生元饮料具有工业可行性。

讨论部分总结：本研究中珍珠粟经植物乳植杆菌DHCU 70发酵伴随测定的总酚酸和总黄酮含量增加及有机酸积累，如优化工艺所证，在晚对数期（18至20.5 h，μ_max 1.38 h^?1）达生长峰值。然而，将这些发酵物转化为稳定合生元需要微包埋以保护益生菌（约10⁹ CFU/mL）、益生元（残余寡糖0.5至0.8 g/L）和后生元（2.99 g/L）免受加工胁迫和胃肠道转运影响。海藻酸钙微珠（1至1.2 mm，12 h收获时EE细胞92.9%、后生元91.3%）在72 h保留约一半载荷，最大损失发生在最初24 h内，减少唾液/胰腺淀粉酶水解和胃缓冲，实现结肠靶向递送，INFOGEST 2.0模拟后存活6.45 log CFU/mL。DSC分析表明发酵因酶促分解和结晶度降低而降低热稳定性，而海藻酸钙及海藻酸盐-明胶包埋通过离子交联和互穿网络形成逐渐改善热稳定性，如转变温度和焓值变化所示。FTIR证实后生元完整性（短链脂肪酸、肽），而低a_w和受控复水动力学支持饮料整合而无活力损失。本研究中活菌数呈S形曲线（μ_max = 0.39 log CFU/mL/h，λ = 5.4 h，R² = 0.984），约18 h达近稳定平台；复合意愿度指数17.5 h达峰并维持平台至22 h，选取该平台内18.0–20.5 h区间，此时活菌数9.15–9.25 log CFU/mL、总测定有机酸27.9–28.7 g/L、可溶性糖耗尽；从拟合动力学模型和多响应准则而非任意时间选择收获时间，减少包埋活细胞和发酵来源成分载荷的变异。包埋时刻保留的晚对数期细胞生理显示优异胃肠道耐受性和靶向模拟结肠递送，由海藻酸钙-明胶基质证明；明胶/海藻酸钙双壳系统提供功能梯度屏障，明胶提供早期胃保护而海藻酸盐促进pH触发的肠道释放；该结构显著改善胃肠道耐受性，模拟盲肠条件下存活6.45 log CFU/mL，相对游离细胞活力损失大幅降低；机制上，降低的酶水解和增强的缓冲能力保护微珠免受远端肠道代谢；FTIR证实的后生元结构完整性（COO^?和糖苷键谱带）进一步支持加工和消化期间的功能稳定性；核壳构型还限制过早扩散，实现空间靶向释放；从食品配方角度，低水分活度结合受控吸湿性确保环境稳定性，而快速复水动力学实现可规模化且消费者友好的递送；总体而言，该工作将发酵动力学与包埋设计整合，建立稳健、可规模化的合生元食品配方，增强益生元、益生菌和后生元的靶向递送，同时支持将未充分利用的粟米作为可持续和营养敏感食品系统中的高值功能基质。

研究结论翻译：包埋收获时间的选择以发酵动力学及发酵基质的代谢物谱为指导。所得海藻酸盐-明胶微珠在受试模拟胃肠道条件下较游离细胞提高了植物乳植杆菌DHCU 70的存活率。该配方为发酵功能性食品递送系统的进一步开发提供了谷物基平台。