基于AO-OCT的视网膜神经节细胞纵向追踪揭示青光眼临床稳定期仍存在持续性神经元退变

《SCIENCE ADVANCES》：On-going retinal neuronal degeneration despite clinical stability in glaucoma

　　

青光眼是导致不可逆性失明的主要原因之一，涉及视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性丢失。该神经退变的早期检测至关重要，然而当前临床方法通常仅在大量损伤发生后才能识别疾病。本初步研究采用高分辨率自适应光学-光学相干断层扫描（AO-OCT）对青光眼患者及健康志愿者的单个视网膜神经节细胞进行为期3至5年的追踪。结果显示，青光眼组的神经退变程度高于正常衰老。研究人员观察到青光眼组细胞密度年下降率为4.16%至6.86%，远超健康志愿者组观察到的0.27%细胞丢失率。关键的是，AO-OCT能显著更早地检测到疾病进展，比传统OCT提前0.74年、比视野检查提前1.49年识别出细胞丢失。这些发现证明AO-OCT是一种更敏感的工具，能够以更高精度监测青光眼性损伤，可能代表对当前临床成像的重大进步。

研究背景：青光眼是以视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突丢失为特征性标志的视神经病变，不可逆的结构损伤先于可感知的视力丧失。多项研究表明，RGCs可在视野检查发现显著异常之前即已丢失。由于视野检查敏感性低等因素，美国（422万）和全球（7960万）的青光眼发病率可能被低估。青光眼进展缓慢且隐匿，为早期干预带来重大挑战，而缺乏在细胞水平检测疾病发生和追踪进展的敏感生物标志物使这一问题更加复杂。临床上，青光眼进展通过视野平均偏差（MD）、视野模式标准差（PSD）、视野指数、黄斑神经节细胞复合体（GCC）厚度和环视盘视网膜神经纤维层（RNFL）厚度等参数监测。临床稳定性定义为在研究期间标准临床指标上无统计学可检测的进展。然而，这些指标的诊断效用受限于对早期疾病进展检测的低敏感性。例如，Zhang等发现使用MD、视野指数或RNFL检测青光眼进展需要5年时间，而更敏感的GCC指标也需要2.5年。这一延迟导致了一个关键时期，在此期间不可逆的视力丧失可能未被检测和治疗。高分辨率视网膜成像的进展，特别是自适应光学（AO）-光学相干断层扫描（AO-OCT），通过提供单个RGCs的无创三维可视化，提供了一种变革性的替代方案。细胞级分辨率提供了比传统视网膜层厚度或视功能测量更直接且可能更敏感的指标来追踪青光眼性结构损伤导致的RGC丢失。自首次证明在活体人眼中可视化RGC镶嵌体以来，AO-OCT在青光眼中的报道主要是横断面的或纵向随访次数有限。研究人员之前使用AO-OCT记录了青光眼性损伤及其与半视野缺损的关联。其他研究在一或两次随访中研究了内层视网膜形态，关注内核层微囊和弓形缺损附近的RGC丢失等特征。虽然这些研究确立了AO-OCT的潜力，但监测RGCs数年的纵向研究对于理解疾病进展和开发稳健的成像生物标志物至关重要。将AO-OCT应用于纵向追踪青光眼面临四个主要挑战：第一，为证明优于现有方法并连接结构与功能变化，小AO视场图像需要与功能数据精确匹配，需考虑RGC感受野与其在光感受器水平对应视野位置之间的解剖位移；第二，AO-OCT需要区分极缓慢的年龄相关细胞丢失与青光眼性变化，检测和区分这些细微差异需要极高的敏感性；第三，为产生高度准确的定量同时避免区域密度变化带来的偏差，获取的AO-OCT体积需要在数年内以细胞级精度（即几个像素的空间差异）进行配准；第四，青光眼相关的组织重塑使得准确追踪单个RGCs异常困难。从研究人员自己的横断面研究中观察到，神经节细胞层（GCL）胞体直径增大（12.3至14.2 μm）伴随密度丢失（40%至50%），可能提示一种潜在代偿机制，即剩余细胞在相邻细胞丢失后可能发生肥大。上述挑战是巨大的，可能受益于多管齐下的方法来实现敏感的青光眼疾病进展检测。在此，研究人员尝试提出这样一种多管齐下的方法来测量GCL胞体丢失和检测青光眼中的神经元退变。研究人员假设AO-OCT通过提供GCL胞体形态的直接细胞级测量，可能以比传统临床评估（包括结构OCT和功能视野测量）更高的敏感性检测青光眼性神经元丢失。研究人员使用了多模式AO系统[具有AO扫描激光检眼镜（AO-SLO）和AO-OCT通道]以确保随时间精确重新成像相同的视网膜位置。当将AO-OCT结果与视功能数据比较时，研究人员考虑了黄斑区RGCs与光感受器之间的位移。研究人员开发了一种用于纵向分析的新配准算法，并使用深度学习算法实现高度准确的细胞胞体分割。此外，研究人员将研究结构设计为评估青光眼中GCL胞体丢失与半视野缺损的关系。这不仅允许在已知存在差异性细胞丢失的区域探查疾病，还允许使用参与者自身作为参照来理解年龄依赖性和青光眼相关的变化。总体而言，该初步研究提供了一种稳健的策略，用于在纵向访视中共同GCL区域内消除潜在细胞丢失的双重来源（即年龄相关下降和青光眼病理），从而验证AO基生物标志物的更高敏感性，有望推进青光眼监测。研究结果：（1）参与者和临床观察：青光眼组和年龄匹配的健康志愿者队列在年龄、眼轴长度和眼压方面无显著差异。所有青光眼患者按医生指导使用降眼压滴眼液，在研究期间保持眼压稳定并在正常人类生理范围内。（2）青光眼眼与健康眼之间的基线差异：在首次访视时，AO-OCT测量的GCL胞体密度在健康志愿者和青光眼患者的黄斑区呈现不同分布。健康眼GCL胞体密度在3°、6°和12°处分别为24,114 ± 4199、16,885 ± 3774和4289 ± 874 cells/mm2。青光眼眼在相应位置显示降低的密度：14,437 ± 9736、8670 ± 3184和3043 ± 1022 cells/mm2。青光眼患者的对称指数（0.56 ± 0.30；P = 0.02）显著低于健康志愿者（0.82 ± 0.14）。青光眼患者的GCL胞体直径在所有离心率处均显著大于健康志愿者（P < 0.05）。最大的胞体直径在12°处测量（15.6 ± 0.9 μm），在6°（13.6 ± 1.3 μm）和3°（13.1 ± 1.0 μm）处逐渐减小，但始终大于健康志愿者组的测量值（12°：14.3 ± 1.3 μm；6°：12.8 ± 0.4 μm；3°：11.7 ± 0.4 μm），分别增加12%、11%和9%。临床上，两个队列均使用黄斑OCT扫描评估视网膜结构和功能测量，青光眼队列还进行标准视野检查。从黄斑OCT扫描中提取GCL厚度，从视野报告中提取模式偏差（PD）值。GCL厚度在两个队列中均随离心率增加而减小，青光眼患者在3°（P = 0.008）和6°（P = 0.012）离心率处显示显著低于健康志愿者的厚度，但在12°处无显著差异（P = 0.691）。AO-OCT衍生的GCL胞体密度在健康志愿者组中与临床测量的局部GCL厚度呈强相关（r = 0.89），但在青光眼组中仅呈弱相关（r = 0.68）。其他临床指标如RNFL、GCC和IPL厚度与AO-OCT的相关性较GCL厚度更弱。这些发现表明，尽管GCL厚度是传统OCT（厚度）测量中估计GCL胞体密度的最佳替代指标，但在本研究队列所代表的早至中期青光眼中，它是GCL胞体密度的较不直接替代指标。AO-OCT的GCL胞体密度结构测量与某些功能视野PD测量显示中至强相关，决定系数范围为0.29至0.77（3°和6°处P < 0.05，12°处P = 0.11）。斜率小于1表明在12°处结构丢失先于功能丢失。（3）长期形态学评估：研究人员在3年内实现了纵向重叠区域，健康志愿者为1° ± 0.2°，青光眼患者为0.9° ± 0.3°（来自1.5°采集视场，约66%重叠）。然而，约10.6%（180个中的19个）的成像目标偏离基线访视，导致无纵向重叠的区域。这些偏差主要由固视变化引起，但仍产生可定量数据。健康志愿者的平均年GCL细胞丢失率为0.27%。空间上，丢失在上、下半视野之间在任何离心率处均无显著差异。青光眼患者的平均GCL细胞丢失率差异很大，范围为1.15至27.9%/年（所有患者和位置的平均值 ± SD = 9.6 ± 7.0），具有明显的区域变异。根据每位青光眼患者识别的半视野缺损，位置被指定为“更多病变”或“更少病变”；具体而言，对应于PD丢失更大的视野半侧的三个上方或下方视网膜位置（3°、6°和12°）被分类为更多病变。研究人员发现更多病变半视野的GCL细胞丢失率（?6.86%/年）高于更少病变半视野（?4.16%/年）。与健康志愿者相比，青光眼患者的胞体大小显著增加（所有位置合并，P = 0.03），更多病变半视野为1.52%/年，更少病变半视野为0.95%/年。相反，健康志愿者在研究期间胞体大小无显著变化（P = 0.27）。青光眼患者更少病变半视野的GCL变薄（0.87%/年）与健康志愿者（0.91%/年）无显著差异（P = 0.19）。相反，更多病变半视野表现出显著（P < 0.01）更大的GCL变薄，为3.0%/年。PD变化在青光眼患者更多病变（P = 0.24）或更少病变（P = 0.51）半视野中均无显著趋势。AO-OCT和临床OCT的GCL厚度测量在大多数区域统计学相似，除3°位置外。AO-OCT分割GCL的体积分解显示，在青光眼队列中胞体体积部分随时间减少6%，非细胞部分增加6%。健康志愿者的细胞和非细胞成分比例随时间不变。在青光眼队列总体GCL体积减少11%中，绝对值的胞体体积减少30%，而非细胞体积仅减少2%。这表明尽管存在一些代偿性胞体增大，青光眼中的GCL变薄主要归因于RGC丢失。纵向椭圆率在青光眼患者和健康志愿者之间无显著差异（Mann-Whitney U，P = 0.67），且在青光眼患者更多病变或更少病变半视野（P = 0.58和P = 0.85）或健康志愿者（P = 0.55）中随时间无显著变化，表明胞体形状在观察期内保持。（4）比较斜率分析：研究人员进行了纵向斜率分析以确定GCL胞体密度、GCL厚度和PD归一化年丢失率之间的关系。结果显示丢失率根据半视野缺损呈现区域变异性。总体而言，年丢失率较低且与临床衍生的GCL厚度（r2 = 0.27）和PD（r2 = 0.32）呈弱线性决定系数。相反，研究人员观察到与GCL胞体密度更大的斜率和更强的线性决定系数（r2 = 0.78）。斜率和决定系数结果共同表明，GCL胞体密度更敏感，可能比传统GCL厚度和PD测量更好地预测青光眼患者异质性GCL胞体丢失的状态。（5）AO-OCT显著早于临床标准检测到神经元退变：对四位有六次访视的青光眼患者（1541、4179、4856和8533）进行了神经退变分析，使用GCL厚度、视野PD和GCL胞体密度测量。神经退变（或进展）事件基于随时间显著负斜率（P < 0.05）识别。例如，患者4179在3I位置表现出GCL厚度年下降9.4%和GCL胞体密度年下降14.5%。对于该患者，AO-OCT衍生的GCL胞体密度比GCL厚度临床测量提前0.58年检测到进展。对每位患者的每位患者进行了Kaplan-Meier分析以确定GCL胞体密度、GCL厚度和PD的累积进展比例。到研究期末，四位青光眼患者24个成像位置的进展比例分别达到：GCL胞体密度42%、GCL厚度17%、PD 8%。GCL胞体密度在进展检测率方面优于GCL厚度和PD。GCL胞体密度比GCL厚度提前0.74年检测到进展，比视野PD提前1.49年。讨论部分：这项多年纵向研究表明，AO-OCT结合严格的分析方法为青光眼的细胞变化提供了前所未有的视角，能够以显著高于当前临床成像技术的敏感性检测疾病神经元退变。主要发现是：（i）AO-OCT能清楚区分青光眼较高的RGC丢失与较低的衰老相关丢失；（ii）AO-OCT直接细胞计数规避了替代性GCL层（或GCC）厚度和主观功能视野测量的局限性，这些方法敏感性较低；（iii）AO-OCT衍生的生物标志物可能比传统方法提前数年检测到统计学显著的神经元退变。研究的一个关键优势是能够区分病理性RGC丢失与自然衰老过程。健康志愿者年丢失率0.27%的测量与组织学和影像学研究将年龄相关RGC和轴突丢失定在0.1至0.6%/年范围内高度一致。在这种缓慢的生理基线背景下，队列中青光眼眼表现出高3至30倍的病理性衰减率。这是对技术敏感性的关键验证。重要的是，在小队列中，传统OCT衍生的GCL厚度不足以区分青光眼患者更少病变半视野的变薄与健康志愿者，这强调了基于大体组织层厚度测量分析的关键局限性。然而，AO-OCT在这些相同区域检测到显著的细胞丢失，突出了其检测早期疾病进展的优越敏感性。该工作还有助于理解青光眼中的细胞形态学变化。青光眼眼中GCL胞体直径增加的观察证实了先前的横断面报告，可能代表细胞重塑，即剩余细胞扩张以填补神经元丢失留下的空隙。年丢失率与传统指标（GCL厚度和PD）之间的弱相关性与AO-OCT衍生胞体密度的强相关性形成对比，强调了细胞分辨率成像克服传统结构评估在青光眼监测中的地板效应和测量变异性的潜力。研究人员注意到更多与更少病变半视野区域之间的斜率差异在GCL胞体密度上数值上大于GCL厚度。然而，在无疾病情况下，GCL厚度在健康志愿者中随时间无显著变化，而胞体密度显示小幅但可检测的年龄相关下降，表明GCL胞体密度从健康衰老到晚期青光眼全范围内更大的动态范围支持其作为敏感指标的效用。相对敏感性的解释是复杂的，需要在更大的前瞻性研究中确认。此外，GCL的体积分解表明RGC胞体体积减少大幅超过大体GCL变薄，有一些结构重塑的证据（代偿性胞体增大和非细胞物质扩张），这是传统OCT无法检测但AO-OCT可以分辨的。研究结果表明细胞级结构标志物在青光眼评估中可能比组织级结构标志物更有效。关键区别在于测量本身的性质：AO-OCT提供存活神经元的离散定量计数，而传统OCT提供层厚度的大体测量。健康眼中RGC胞体密度与GCL厚度之间的强相关在青光眼眼中减弱的观察指向GCL内发生的复杂病理变化。临床OCT测量的GCL厚度是一种综合测量，不仅包括RGCs，还包括必需的胶质支持细胞如星形胶质细胞和Müller细胞。在健康视网膜中，RGC胞体密度是GCL厚度的重要决定因素，导致观察到的强相关。然而，在青光眼中，关系变得更加复杂，因为多种细胞和结构变化同时发生。胶质细胞可能发生反应性胶质增生，其他病理过程如细胞肿胀、细胞外基质重塑或炎症反应可能独立于RGC数量改变GCL厚度。GCL的动态变化包括存活RGCs的变化，如胞体增大或树突萎缩，因为视网膜试图补偿细胞丢失并重建突触连接。因此，总体GCL厚度可能不会与凋亡RGCs的真实数量成比例下降。青光眼中GCL厚度与胞体密度之间减弱的横断面相关性与纵向体积发现定量一致，即胞体体积下降30%而总体GCL体积仅下降11%，非细胞部分增加6%。这种结构重塑部分减弱了相对于真实神经元丢失的厚度信号，解释了为什么GCL厚度在青光眼中是胞体密度的较不直接替代指标。然而，观察到的GCL胞体密度与PD之间的结构-功能相关性证实直接细胞计数仍然是神经元健康的稳健且功能相关的测量。观察到的适度结构-功能相关性（r = 0.54至0.88）在标准视野固有的高重测变异性下是预期的。因此，在这种高度局部化的细胞尺度上检测到显著的结构-功能关系的能力进一步验证了AO-OCT在捕获生物学相关损伤方面的敏感性。这些发现与青光眼定义为导致RGC变性和死亡的慢性进行性视神经病变一致，而非仅由眼压升高定义的疾病。这项工作为临床众所周知的现象提供了潜在的细胞解释：一些患者尽管眼压降低至预定义目标，仍持续结构和功能恶化。大型纵向研究表明，尽管眼压降低减少了进展风险和速率，但并未完全阻止所有眼的疾病活动。在早期 manifest 青光眼试验中，治疗眼比未治疗对照进展频率更低，但相当比例仍显示随时间进展。同样，协作正常眼压青光眼研究表明降低眼压显著减少了进展风险，但有意义的一部分治疗眼继续恶化，提示一旦损伤启动，神经退行性过程持续存在。在此背景下，研究人员在标准治疗全局指标（包括所有视野和传统OCT指标）临床稳定的眼中观察到持续的RGC胞体丢失，突出了临床稳定性与细胞稳定性之间的分离，表明青光眼性神经退变可能在传统测量看似不变时仍在持续，且这可能很常见。这项工作的相关性在于其直接量化持续神经元丢失的能力；如果此类测量在临床上可用，它们可能促使考虑在选定的眼中进一步降低眼压或替代干预。更根本的是，这些发现强调了青光眼中神经保护疗法的必要性，并表明RGC密度和形态的体内定量可能代表未来神经保护试验的理想生物标志物，直接测量神经元完整性而非仅依赖间接结构或功能替代指标。从临床转化角度来看，最具影响力的发现是AO-OCT提供的进展检测的实质性提前时间。数据显示AO-OCT比当前临床标准治疗方法（GCL厚度和PD）提前近一年识别出显著的RGC丢失，且在传统方法完全失败的情况下也能检测到。这种能力可能对新的治疗试验和患者管理具有变革性。虽然该技术的实际要求目前限制了其广泛临床应用，但这项工作代表了朝着更敏感疾病监测的重要一步。对于开发神经保护疗法，使用敏感的细胞终点可以显著缩短试验持续时间、减少样本量和降低成本。高分辨率AO-OCT成像检测青光眼进展面临若干技术挑战，目前限制了转化但为未来创新领域提供了机会。目前，细胞级成像受限于相对较小的视场，这一限制主要由AO-OCT系统固有的慢采集速度驱动。然而，新兴技术进步，特别是兆赫兹速度AO-OCT平台的发展，通过实现更大视场成像和促进能够捕获更广泛视网膜区域同时保持细胞分辨率的详细拼接图的创建，有望解决这些限制。除了扩大成像区域，更快的采集速度将大幅降低对眼动伪影的敏感性，目前眼动伪影损害图像质量并需要使用稳健的配准算法。此外，人工智能驱动的图像处理算法的整合可能通过减少或可能消除大量帧平均的需求来革新高分辨率成像工作流程，从而加速数据采集同时保持可靠细胞可视化所需的信噪比。总体而言，这些技术创新——涵盖硬件和计算进步——代表了高分辨率AO-OCT成像设备向更临床实用和可及的青光眼筛查和监测转化的途径。研究的主要局限性是样本量小。然而，研究的优势在于来自少数个体的高密度纵向数据，这展示了技术敏感监测的能力。鉴于纵向研究的性质，时间点在模态之间并非完全等间距。然而，鉴于每种模态检测到的变化，研究人员不预期不等采样会改变论文的主要结论之一：AO-OCT比临床OCT或功能视野测试更早检测到显著细胞丢失。未来更大的队列和多中心研究可能建立AO-OCT指标的规范数据库。未来工作可以专注于开发全自动端到端分析流程以提高通量和客观性，使技术更适用于临床试验并最终常规实践。开发更可及和成本效益更高的AO-OCT系统对于更广泛采用也可能至关重要。如本文所示，AO-OCT衍生的RGC健康指标是高度敏感的生物标志物。随着进一步验证，这些指标可能作为强大的临床试验终点，可能缩短试验持续时间并加速青光眼新神经保护疗法的开发。该研究将AO-OCT定位为能够量化细胞级变化的科学仪器，突出其在青光眼监测和作为理解细胞病理生理学工具方面的潜力。研究方法：五名青光眼患者（62.2 ± 5.2岁）和五名年龄匹配的健康志愿者（65.3 ± 6.8岁）被纳入这项纵向研究。研究方案经美国食品药品监督管理局（FDA）机构审查委员会批准，遵循赫尔辛基宣言的原则。所有参与者均通过前房角镜检查记录为开角，并在每次访视时接受标准眼科检查，包括视盘摄影、OCT（环视盘和黄斑扫描，Spectralis OCT；Heidelberg Engineering GmbH，Heidelberg，Germany）和标准自动视野检查（Humphrey Field Analyzer；Carl Zeiss Meditec Inc.，Dublin，CA，USA）。24-2和10-2 SITA标准方案均用于视野检查。所有青光眼患者均已超过学习曲线阶段。青光眼诊断由经验丰富的青光眼专家根据美国眼科学会实践模式确认。每位参与者的一只眼被成像用于本研究。排除标准包括介质混浊、高血压、共存的眼部疾病（如糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性）、除简单白内障或青光眼手术外的眼部手术史、不可靠的视野检查或无法保持固视。对于四名青光眼患者（1541、4179、4856和8533），AO-OCT图像在六次不同成像会话中采集，间隔181 ± 33天（目标：182.5天或6个月）。另一名青光眼患者（1733）被成像两次，间隔4.7年。所有年龄匹配的健康志愿者被成像两次，间隔4.5 ± 0.3年。每次成像会话中，使用FDA多模式AO系统在830 nm（?λ = 60 nm）下以210-kHz A扫描速率采集AO-OCT体积。照明功率保持在430 μW以下，遵守美国国家标准学会Z80.36-2021概述的安全阈值。系统焦点调整至约GCL以最大化RGC胞体的对比度。AO-OCT体积在六个黄斑位置采集：水平中线以上和以下各三个2.5°，在3°、6°和12°颞侧视网膜离心率处。对于每个视网膜位置，采集30个AO-OCT视频（每个视频10个体积），视场为1.5° × 1.5°（约0.2 mm2视网膜），300 × 300横向像素采样。在每个参与者的重复会话中重新成像相同的六个视网膜位置。AO-OCT体积使用标准OCT处理步骤重建，三维配准并平均。对于纵向评估，来自六次会话的平均体积进一步使用中间毛细血管丛的en face投影进行横向配准。使用自动机器学习算法检测和分割配准体积重叠区域内的GCL胞体，并由三名分级员之一手动校正。手动排除含有血管的区域以确保准确的细胞密度计算。为计算GCL胞体密度，将三维GCL胞体中心位置投影到单个en face平面，并对胞体镶嵌体应用Voronoi分析。GCL胞体密度计算为Voronoi细胞总数与这些Voronoi斑块所 encompassed 累积面积的比率。GCL胞体直径从每个分割胞体在其中心深度平面的en face投影计算。临床视野合格标准为固视丢失<20%和假阳性错误<15%。临床OCT合格标准为图像质量测量>20。研究人员将每位参与者的OCT层厚度和视野PD值插值到对应于六个AO成像位置的区域。对于视野，研究人员使用了Watson建模的RGCs与光感受器之间的投影。进展分析使用OCT衍生的GCL厚度和AO-OCT衍生的密度参数进行。在每次访视时，从基线到当前访视分析参数，从第二次随访访视开始。遵循Zhang等的方法，使用Kaplan-Meier生存分析对有至少五次随访访视的患者识别进展，当检测到显著（P < 0.05）负斜率时，表明GCL厚度测量的层变薄和GCL胞体密度测量的细胞丢失。显示显著趋势的首次访视被记录为进展检测时间点。Kaplan-Meier分析基于每个位置而非每位患者进行，以考虑黄斑区细胞丢失的个体空间差异。研究结论（翻译）：这项多年纵向研究表明，AO-OCT结合严格的分析方法为青光眼的细胞变化提供了前所未有的视角，能够以显著高于当前临床成像技术的敏感性检测疾病神经元退变。这些发现证明AO-OCT是一种更敏感的工具，能够以更高精度监测青光眼性损伤，可能代表对当前临床成像的重大进步。