《SCIENCE ADVANCES》：BCLAF1 links RNA splicing to ATF4-dependent metabolic adaptation in acute myeloid leukemia
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急性髓系白血病（AML）由遗传改变和非突变机制驱动，这些机制破坏正常造血并支持白血病细胞存活。虽然AML的突变图谱已被充分表征，但维持白血病状态的非遗传过程仍知之甚少。研究人员利用人AML细胞和鼠类模型，鉴定出BCL2相关转录因子1（BCLAF1）通过控制mR
急性髓系白血病（AML）由遗传改变和非突变机制驱动，这些机制破坏正常造血并支持白血病细胞存活。虽然AML的突变图谱已被充分表征，但维持白血病状态的非遗传过程仍知之甚少。研究人员利用人AML细胞和鼠类模型，鉴定出BCL2相关转录因子1（BCLAF1）通过控制mRNA加工成为白血病进展的关键调控因子。BCLAF1与核心剪接体组分物理结合，并调控白血病细胞中的可变剪接程序。机制上，BCLAF1是激活转录因子4（ATF4）mRNA有效剪接所必需的，从而维持ATF4蛋白水平及下游代谢基因表达程序。BCLAF1缺失降低ATF4水平，导致从头氨基酸生物合成受损并增加对venetoclax的敏感性。总之，这些发现揭示了一种此前未被认识的联系RNA剪接调控与AML代谢适应的机制，将BCLAF1确定为潜在的治疗脆弱性靶点。
**研究背景**
急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液恶性肿瘤，以未成熟髓系前体细胞的克隆性扩增为特征。尽管许多患者最初对化疗有反应，但大多数最终因耐药性白血病干细胞（LSCs）的持续存在而复发。尽管近年来治疗取得了进展，AML在很大程度上仍不可治愈，5年总生存率约为20%，这凸显了深入研究机制和新治疗靶点的必要性。AML是一种生物学上高度异质的疾病，由广泛的体细胞致癌突变驱动。其中，剪接体基因突变存在于10%–25%的病例中，尤为突出。尽管其精确的致癌作用尚未完全阐明，但越来越多的证据表明异常mRNA剪接是白血病发生的关键介质。值得注意的是，携带剪接体突变的AML细胞对剪接机器的扰动表现出选择性敏感性，突显了剪接体作为有前景的治疗靶点。相比之下，维持AML的非突变分子过程定义较少。其中一个过程是代谢重编程，最近已成为白血病发生的标志。LSCs表现出升高的氨基酸摄取和分解代谢以支持氧化磷酸化。此外，AML细胞对特定氨基酸表现出特定的依赖性，突显了靶向氨基酸代谢的治疗潜力。然而，协调这些代谢适应的上游调控机制仍定义不清。新兴证据表明mRNA剪接与细胞代谢相互关联。代谢信号广泛调控mRNA剪接程序，使细胞能够快速适应营养可用性和应激。相反，最近的工作表明剪接机器的扰动可以重塑细胞代谢状态，包括在髓系恶性肿瘤中。然而，将剪接调控与AML代谢重编程联系起来的分子机制仍不完全清楚。在本研究中，研究人员揭示了BCLAF1在将RNA加工与AML中氨基酸代谢程序偶联中的核心作用。
**关键技术方法**
研究人员利用人AML细胞系（MOLM-13、THP-1、OCI-AML3、HL-60）和鼠类MLL-AF9白血病模型开展了研究。主要技术方法包括：免疫共沉淀联合质谱（IP-MS）鉴定BCLAF1相互作用蛋白；RNA测序（RNA-seq）和MAJIQ工具分析可变剪接事件；BCLAF1 RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）和RIP-qPCR鉴定直接靶标mRNA；同位素示踪实验（U-13C-葡萄糖）结合气相色谱-质谱（GC-MS）评估从头氨基酸合成；以及CRISPR/Cas9基因编辑技术在原代人AML样本中进行功能验证。原代人AML样本来源于华盛顿大学医学院生物样本库（IRB 201011766）。
**研究结果**
**BCLAF1支持AML发病机制**：通过TCGA泛癌分析发现BCLAF1在AML中表达最高，且显著高于健康造血组织。在MOLM-13和THP-1细胞中进行生长竞争实验，证实BCLAF1是人AML细胞增殖所必需的。DOX诱导性shRNA敲低BCLAF1导致细胞增殖减少、CD11b表达增加及形态学分化改变，而凋亡变化有限。BEAT-AML队列分析显示BCLAF1低表达患者富集髓系分化相关基因，耗竭原始/祖细胞相关程序。在MLL-AF9驱动的鼠AML模型中，Vav-Cre:Bclaf1
f/f小鼠白血病发生率降低（54% vs 87%）、中位生存期延长（141天 vs 83天）。体外Cre介导的Bclaf1缺失损害AML细胞扩增和集落形成能力。在原代人AML样本中，CRISPR/Cas9靶向BCLAF1显著损害集落形成和细胞扩增。
**BCLAF1调控AML细胞中的mRNA剪接**：IP-MS鉴定出19个BCLAF1特异性相互作用蛋白，富集于剪接体复合物组分和mRNA剪接加工类别。免疫荧光显示BCLAF1定位于核斑点（nuclear speckles），与SRRM2部分共定位，BCLAF1缺失减少核斑点的大小和数量。RNA-seq结合MAJIQ分析发现BCLAF1敲低导致1503个显著改变的可变剪接事件，以内含子保留为主。RIP-seq鉴定出3567个BCLAF1显著富集的转录本，与剪接改变转录本存在显著重叠，RIP-qPCR验证了BCLAF1与选定转录本的特异性结合。
**BCLAF1促进氨基酸代谢基因表达**：BCLAF1敲低后差异表达分析鉴定出539个差异表达基因。上调基因富集于免疫相关过程和髓系分化程序，HOXA簇转录本显著下调。下调基因显著富集于氨基酸代谢通路，特别是转运和生物合成。RT-qPCR和免疫印迹证实氨基酸转运体（SLC38A1、SLC7A5）和生物合成酶（ASS1、PHGDH、PYCR1）在mRNA和蛋白水平均下调。
**BCLAF1缺失破坏从头氨基酸合成**：GC-MS分析显示BCLAF1敲低后脯氨酸和精氨酸胞内水平显著降低。U-13C-葡萄糖示踪实验表明，尽管糖酵解和三羧酸循环中间产物标记无差异，但丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸的
13C掺入显著减少，而未标记丝氨酸积累。关键生物合成酶（PHGDH、PSAT1、PSPH、SHMT2、GPT2）表达下调。外源氨基酸补充未能挽救增殖缺陷。BCLAF1缺失增强venetoclax诱导的凋亡并增加对venetoclax的敏感性。
**BCLAF1通过ATF4支持氨基酸代谢**：TRRUST数据库转录因子富集分析鉴定ATF4为BCLAF1下调基因集中最显著富集的转录因子。ENCODE ChIP-seq数据显示75%的BCLAF1下调氨基酸代谢基因有ATF4结合。BCLAF1敲低后ATF4蛋白水平显著降低，在Bclaf1缺陷鼠白血病和多种遗传背景的AML细胞系中均得到验证。ATF4敲低表型模拟BCLAF1缺失，包括增殖受损、氨基酸代谢基因表达降低、从头氨基酸合成受损和venetoclax敏感性增加。
**BCLAF1独立于经典ISR激活维持ATF4表达**：BCLAF1敲低不影响ISR激酶水平和eIF2α磷酸化，tunicamycin处理后ATF4水平仍较低。ISRIB处理对BCLAF1敲低细胞增殖影响极小，BCLAF1缺失未诱导蛋白质稳态应激或代偿性自噬。然而，OPP掺入实验显示BCLAF1敲低后新生蛋白合成减少，ATF4敲低表型模拟此效应。GSEA显示BCLAF1敲低后核糖体生物合成相关基因显著下调。
**BCLAF1控制ATF4 mRNA可变剪接**：ATF4 mRNA存在两种主要剪接变体：保留第一内含子的V1（不稳定，核滞留降解）和编码 canonical ATF4蛋白的V2。BCLAF1敲低后V1/V2比值显著增加，总ATF4 mRNA水平降低。RIP-qPCR显示BCLAF1特异性结合ATF4转录本，且优先结合V1异构体。BEAT-AML队列分析显示BCLAF1低表达患者ATF4 mRNA水平显著降低，BCLAF1与ATF4 mRNA水平呈强正相关。
**讨论与结论**
研究 Discussion 部分指出，多种RNA结合蛋白（RBPs）已被鉴定为白血病细胞存活所必需，突显了转录后控制在AML发病机制中的重要性。本研究鉴定BCLAF1为AML中重要的转录后调控因子，通过调控可变mRNA剪接促进白血病维持。BCLAF1最初被鉴定为具有促凋亡和转录抑制功能的BCL2相互作用蛋白，但后续研究揭示了其更广泛的上下文依赖性作用，包括DNA损伤反应、病毒感染和细胞分化。本研究鉴定BCLAF1在AML中调控mRNA剪接程序的作用，区别于其最初描述的与BCL2的关联。研究人员发现BCLAF1在携带核心剪接因子基因突变的AML患者中表达升高，提示其功能可能在该遗传背景下尤为重要。研究鉴定应激响应转录因子ATF4为BCLAF1的关键下游效应因子。BCLAF1与ATF4 mRNA结合并调控其剪接，减少内含子保留的不稳定变体并维持稳定的蛋白编码异构体。近期研究强调靶向氨基酸代谢通路在AML中的治疗潜力，但白血病细胞可通过诱导ATF4表达适应营养应激。本研究结果表明BCLAF1可能通过调控ATF4表达贡献于这种适应能力。BCLAF1缺失增强venetoclax诱导的凋亡， reduced ATF4活性可能贡献于此表型。BCLAF1广泛表达但显示细胞类型依赖性功能，在肿瘤发生中可作为肿瘤促进因子或抑制因子。研究人员此前的工作表明，BCLAF1虽促进胎儿造血干细胞发育和移植后造血重建，但在稳态条件下对成体HSCs的维持是非必需的，提示靶向BCLAF1可能优先损害白血病细胞而非正常造血。
研究结论（翻译）：总之，这些发现揭示了一种此前未被认识的联系RNA剪接调控与AML代谢适应的机制，将BCLAF1确定为潜在的治疗脆弱性靶点。
