《SCIENCE ADVANCES》：Engineered synbiotic microspheres enable system-level reprogramming of the gut-immune-vascular axis in chronic inflammatory vascular disease
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慢性炎症性血管疾病日益被认识为由适应不良的跨器官免疫代谢偶联所维持的系统性疾病，然而当前治疗策略仍以病灶为中心，未能解决疾病持续存在的上游驱动因素。本研究鉴定肠道-免疫-血管轴为整合肠道微生物失调、肠道屏障功能障碍、代谢失衡与血管免疫激活为自我强化病理回路的系
慢性炎症性血管疾病日益被认识为由适应不良的跨器官免疫代谢偶联所维持的系统性疾病，然而当前治疗策略仍以病灶为中心，未能解决疾病持续存在的上游驱动因素。本研究鉴定肠道-免疫-血管轴为整合肠道微生物失调、肠道屏障功能障碍、代谢失衡与血管免疫激活为自我强化病理回路的系统级致病单元。通过整合临床 profiling 与跨物种验证，研究证明该轴的破坏以协调的益生菌耗竭、促炎类群扩增、微生物内毒素易位、微生物群衍生代谢物蓄积以及沿肠道-血管连续体的巨噬细胞向促炎表型极化为特征。为靶向治疗该轴，研究人员工程化酶响应性合生元微球，在保护性聚合物基质内共递送益生菌、微生物代谢通路抑制剂与益生元，实现肠道部位特异性激活与协调的微生物群-代谢调节。该工程化系统恢复肠道屏障完整性、重编程微生物生态与代谢物输出、抑制免疫代谢功能障碍，并在细胞、小鼠及大型动物模型中稳健减轻病理性血管重塑，以支架内再狭窄（ISR）作为代表性疾病情境。总之，本研究确立轴导向免疫代谢重编程为可推广的治疗范式，并突出工程化合生元平台作为慢性炎症性疾病系统级干预的可规模化工具。
【研究背景】慢性炎症性血管疾病传统上被视为由病灶特异性损伤和适应不良性血管修复驱动的局部性疾病，但越来越多证据表明血管病理由超越血管壁的系统性过程维持，涉及代谢、免疫与屏障组织间的协调互作。肠道微生物群及其代谢输出的扰动已成为宿主免疫与血管稳态的重要调节因素，但这些效应通常被孤立研究，很少整合入统一的疾病框架。因此当前治疗策略仍以病灶为中心，未能解决强化慢性血管炎症与重塑的上游跨器官驱动因素。心血管疾病（CVD）仍是全球首要死因，冠心病（CHD）主要由急性心肌梗死驱动，每年约1790万人死亡，占全球死亡近30%。动脉粥样硬化是大多数CVD的基础；不稳定斑块破裂导致急性冠状动脉狭窄/闭塞是致死性CHD事件的主要机制。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是快速血运重建与心肌挽救的基石疗法，2023年中国手术量超140万例。支架植入因 superior 防止弹性回缩和维持管腔通畅能力而成为主导PCI方式，但其长期获益受支架内再狭窄（ISR）严重削弱。ISR发生于超10%患者，与复发性心肌梗死和死亡风险显著增加相关。ISR长期被视为局部血管并发症，但其高复发率和有限治疗持久性提示涉及超越支架病灶本身的上游系统机制。尽管广泛研究，ISR机制仍未完全明了，涉及内皮功能障碍、炎症激活、斑块失稳和血栓形成等多病理过程，而非单一始动事件，其上游驱动因素和相互偶联尚未阐明。越来越多证据表明肠道微生物群及其代谢物可能在多个层面同时参与并放大这些病理改变。微生物失调可削弱肠道屏障完整性、促进内毒素易位、扰乱脂质和胆汁酸代谢、加剧系统性炎症，从而对血管稳态产生持续影响。具体而言，微生物衍生的脂多糖（LPS）诱导肠道通透性增加（“肠漏”），加重内皮损伤和炎症反应；微生物代谢失调升高循环低密度脂蛋白（LDL）水平，加速斑块形成；氧化三甲胺（TMAO）促进泡沫细胞蓄积和血小板活化，增加斑块破裂和血栓形成风险。这些跨器官多通路相互作用被概念化为“肠道-斑块轴”，可能构成驱动ISR起始和进展的机制基础。在此框架下，ISR不再被视为局部血管反应，而是肠道微生物稳态破坏的系统性病理后果。微生物组分析研究表明ISR患者肠道微生物组成显著改变，支架相关动脉粥样硬化斑块含大量肠道来源微生物和代谢物。动物研究进一步证明肠道微生物状态强烈影响ISR易感性，粪菌移植双向调节ISR进展。作为健康肠道天然优势益生菌，罗伊氏乳杆菌（Lac.r）抑制病原菌生长、增强短链脂肪酸（SCFA）产生、调节免疫极化，在体外显示抗ISR潜力。然而单独口服Lac.r对体内TMAO生物合成抑制有限，不足以在代谢源头抑制肠道-斑块轴持续激活。相反，3,3-二甲基-1-丁醇（DMB）作为胆碱结构类似物，优先抑制微生物胆碱三甲胺裂解酶（CutC/CutD）介导的三甲胺（TMA）产生，而对 distinct 肉碱加氧酶（CntA/B）通路或细菌活力影响极小。因此整合益生菌介导的肠道微生物稳态恢复与TMA产生的选择性代谢抑制，为肠道-斑块轴全面重编程和ISR持久预防提供了合理策略。本研究开发酶响应性合生元微球，在单一平台内整合微生物群调节、代谢抑制和肠道靶向。海藻酸钠-β-葡聚糖交联微球共包封Lac.r、TMAO抑制剂DMB和菊粉（Alg-βG-Lac.r-DMB-Inu MS），实现肠道部位特异性激活同时保护益生菌并在源头抑制致病代谢物。该系统实现肠道-斑块轴协调重编程，持久恢复肠道稳态、减轻TMAO驱动的免疫代谢功能障碍，并在细胞、小鼠和大型动物模型中有效抑制ISR。本研究确立以肠道微生物群-免疫代谢轴为中心的系统级ISR干预策略，并突出工程化益生菌平台作为复杂血管疾病跨器官精准治疗的可推广范式。论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。
【关键技术方法】研究人员采用微流控离子交联凝胶化策略构建共包封Lac.r、DMB和菊粉的海藻酸钠-β-葡聚糖微球；通过16S rRNA基因测序分析肠道微生物组成与功能；采用粪菌移植（FMT）建立微生物-表型因果关系；在ApoE?/?小鼠高脂饮食模型及大鼠、兔颈动脉球囊损伤联合裸金属支架植入的ISR模型中评估疗效；运用MRI和CTA进行在体影像学评价；采用FISH检测Lac.r组织定位；通过非靶向代谢组学分析代谢重编程；采用流式细胞术评估免疫细胞极化；临床样本来自温州医科大学附属第五医院40名参与者（20例ISR患者和20例健康对照）。
【研究结果】
微生物失调驱动的肠道-斑块轴激活加速ISR进展：通过比较ISR患者与健康对照的肠道微生物群和肠道-斑块炎症轴，发现ISR患者α多样性显著降低、β多样性明显分离，微生物生态系统整体不稳定失衡；组成上呈现益生菌耗竭向促炎类群扩增的特征性转变，Lac.r和乳杆菌谱系显著减少，而普雷沃菌属、脱硫弧菌属、瘤胃球菌属等条件致病和炎症相关菌属显著富集；ISR斑块显示大量LPS沉积，肠道组织上皮屏障破坏、紧密连接蛋白（ZO-1、ZO-3、Claudin-1）显著下调，黏膜LPS蓄积伴M1型促炎巨噬细胞（CD86+）浸润增强和M2型修复性巨噬细胞（CD206+）减少，ISR斑块内观察到高度一致的M1主导巨噬细胞极化表型；ELISA显示肠道组织、血浆和斑块中TMA(O)、IL-1β、IL-18和TNF-α水平升高。这些数据提供临床证据表明肠道-斑块轴异常激活作为ISR上游病理驱动因素。
多功能Alg-βG-Lac.r-DMB-Inu MS的设计与制备：采用微流控离子交联凝胶化策略构建共包封益生菌、代谢抑制剂和益生元的多功能微球，光学成像显示各配方微球呈均匀球形、结构边界清晰，粒径约47 μm、单分散性优良；SEM确认β-葡聚糖掺入形成更致密纹理壳层；元素映射显示各组分均匀分布；微球在pH 1.2结构完整，在含β-葡聚糖酶介质中逐渐壳层松散并控释Lac.r；对Lac.r、DMB和菊粉包封效率高，酸性条件下释放极少、pH 7.4持续释放、β-葡聚糖酶富集介质中加速释放；游离Lac.r在酸性条件下活力快速丧失而包封菌在模拟胃肠液及连续转运中保持显著可回收性和集落形成能力；包封Lac.r在模拟胃肠处理后基本保留乙酸、丙酸和丁酸产生能力；微球4°C冷藏6个月保持结构完整和细菌活力；IVIS成像显示微球在胃肠道2至48小时产生强而广泛荧光信号并持续至96小时，FISH显示Lac.r沿胃肠道分布、从十二指肠到结肠信号渐强，粪便监测显示包封显著延长益生菌持久性。从工程和转化角度，当前益生菌干预的关键局限不在菌株选择，而在活菌载量不足、肠道滞留不稳定和与宿主免疫代谢网络偶联无效。
Alg-βG-Lac.r-DMB-Inu MS重塑肠道-斑块轴恢复微生物-免疫稳态并抑制ISR：在巨噬细胞来源泡沫细胞中复合微球最显著减轻细胞内活性氧（ROS）和脂滴含量；在平滑肌来源泡沫细胞中降低氧化应激并稳定细胞骨架结构，减少F-actin应力纤维形成；在LPS攻击的HUVEC中显著减少细胞内ROS蓄积和脂质沉积同时促进内皮伤口闭合，用丝裂霉素C预处理确认增强修复主要归因于内皮迁移增加而非增殖，EdU实验显示复合微球显著抑制MOVAS增殖；转录谱分析显示RAW264.7和MOVAS来源泡沫细胞中炎症信号、巨噬细胞极化和胆固醇外排相关基因协调调控，Western blot确认ABCA1、ABCG1及CD206、CD86蛋白水平一致调节。在HFD喂养ApoE?/?小鼠中，HFD显著缩短结肠长度，三种微球配方部分恢复肠道形态，复合微球组改善最显著；H&E显示DMB和Lac.r MS组渐进减轻HFD诱导的绒毛损伤和隐窝萎缩，复合配方在小肠结构恢复最显著，结肠亦见一致改善；免疫荧光和免疫组化显示复合微球显著恢复结肠ZO-1表达，结肠和小肠中ZO-1、Occludin和Claudin-1表达显著增加；主动脉油红O染色显示复合微球显著减少斑块面积接近对照表型，filipin染色显示复合微球最显著降低斑块内游离胆固醇，Masson三色染色显示复合微球胶原沉积下降最显著；流式分析显示HFD诱导脾脏CD3+ T细胞扩增伴促炎CD4+和CD8+效应群富集及CD4+CD25+Foxp3+调节性T（Treg）细胞耗竭，复合微球最有效恢复T细胞稳态、正常化效应T细胞比例并强劲扩增Treg细胞群。在大鼠和兔原位ISR模型中，大鼠纵向MRI显示复合微球组从第7天开始显著消退并加速至第14和28天，总体减少约60-70%；组织学显示斑块负荷和内膜-中膜比显著降低50-70%、炎症浸润减少；肠道评估显示绒毛结构恢复、上皮连续性改善和紧密连接完整性增强。兔ISR模型CTA三维血管重建显示复合组管腔恢复最显著（约40-60%改善）；代谢谱显示复合微球组LDL-C、总胆固醇和甘油三酯降低最显著伴HDL-C升高；全身炎症和肠道来源标志物IL-1β、IL-2、IL-18和TMAO下降最显著（约40-65%），抗炎细胞因子IL-10和TGF-β显著恢复；免疫荧光显示内皮覆盖增强（CD31表达增加）伴α-SMA阳性平滑肌重塑减少。
Alg-βG-Lac.r-DMB-Inu MS调节肠道-斑块轴稳态增强SCFA代谢并改善ISR免疫微环境：16S rRNA基因测序显示ISR诱导微生物丰富度和生态完整性显著丧失，复合微球恢复微生物丰富度接近对照状态，优于DMB单用和Lac.r单用干预；Venn分析显示复合微球组共享和独特菌属大量恢复；微生物失调指数（MDI）分析显示复合微球使MDI正常化至近基线水平；主坐标分析、主成分分析和非度量多维标度显示复合微球组明显偏离ISR对照并向对照动物聚类；Kruskal-Wallis H检验和LEfSe鉴定Lac.r给药后乳杆菌属最显著富集，伴ISR相关促炎和失调相关菌属协调抑制；层次聚类确认复合组整体微生物组成接近健康对照；Circos图和共现网络拓扑显示以乳杆菌相关节点为中心的密集平衡微生物互作网络重建，连接器和模块枢纽类群比例增加；COG功能预测显示复合微球选择性富集碳水化合物转运代谢、能量产生和生物合成途径。FISH显示微球处理后肠道内Lac.r定位增强，脾脏和动脉粥样硬化斑块中可检测Lac.r相关信号；TEM显示肠道上皮和斑块内组织相关益生菌存在增加；免疫组化显示肠道ZO-1和ZO-3上调、斑块ABCA1和ABCG1表达升高；双标免疫荧光显示肠道和斑块组织中CD86+促炎巨噬细胞显著减少伴CD206+修复性巨噬细胞增加，方向一致支持同步免疫重塑。非靶向代谢组学显示复合微球给药后代谢组成显著改变，SCFA相关代谢物广泛上调，靶向定量确认乙酸、丙酸和丁酸显著升高；体外发酵实验显示菊粉存在下Lac.r衍生SCFA产生显著放大。巨噬细胞来源泡沫细胞暴露于生理相关浓度SCFA显示剂量依赖性减轻细胞内脂质蓄积、CD86+促炎巨噬细胞浓度依赖性减少伴CD206+修复性巨噬细胞增加，RT-qPCR显示SCFA抑制iNOS表达同时上调ARG-1和胆固醇外排基因ABCA1和ABCG1，Western blot一致；SCFA剂量依赖性降低泡沫细胞ROS，丁酸抗氧化效果最显著；SCFA减弱平滑肌来源泡沫细胞F-actin应力纤维组织和细胞骨架激活；SCFA加速LPS攻击HUVEC伤口闭合。
Alg-βG-Lac.r-DMB-Inu MS的系统性生物安全性评估：H&E染色显示主要器官（心、肝、脾、肺、肾）组织结构保存完好，无炎症浸润、实质坏死、纤维化或结构破坏；血清生化显示肝功能标志物和肾功能参数各组间无显著差异；常规血液学指标无异常改变。这些发现表明复合微球在长期体内给药下具有良好生物相容性和系统性安全性。
【讨论与结论】本研究将ISR重新概念化为系统级轴功能障碍的表现而非纯病灶中心血管并发症。通过整合临床观察与跨物种机制分析，研究证明病理性血管重塑由连接微生物失调、肠道屏障破坏、免疫代谢失衡和斑块炎症为自我强化回路的适应不良性肠道-免疫-血管轴维持。该框架挑战了再狭窄主要源于局部血管损伤和不完全内皮修复的主流范式，将ISR定位于由跨器官偶联驱动的更广泛慢性炎症性血管疾病类别。该轴导向视角为现有病灶靶向干预有限持久性提供统一解释，并揭示可治疗性利用的上游系统级脆弱性。研究结论：本研究确立轴导向免疫代谢重编程为可推广的治疗范式，并突出工程化合生元平台作为慢性炎症性疾病系统级干预的可规模化工具。
