细胞类型特异性先天性心脏病变异遗传解析揭示ETS1调控血管平滑肌细胞命运

《SCIENCE ADVANCES》：Genetic dissection of cell type–specific congenital heart disease variants reveals ETS1 control of vascular smooth muscle cell fate

　　

大量先天性心脏病（CHD）风险变异位于顺式调控元件中，然而抑制性和二价染色质中的变异对细胞类型特异性心脏发育的影响尚不清楚。在此，研究人员通过联合分析单个细胞中的H3K27ac、H3K27me3、H3K4me3和转录组，构建了人类心脏分化的单细胞多组学图谱，将顺式调控元件分为六种染色质状态，从而优先筛选出610个与CHD相关的非编码变异，这些变异富集于谱系和状态特异性调控元件中，包括抑制性和二价区域。对选定变异进行CRISPR敲入扰乱了邻近基因表达并损害了心脏分化。对ETS1（ETS原癌基因1）附近一个Polycomb标记变异的解析揭示了局部H3K27me3丢失、H3K27ac获得和ETS1上调，这在早期阶段将分化重定向至具有上皮特征的第二心场祖细胞，并最终导向高迁移性的ETS1⁺血管平滑肌细胞。总之，该工作建立了一个用于解释非编码CHD风险变异的单细胞染色质状态框架，并揭示了一个由ETS1驱动的程序，将Polycomb失调的非编码变异与人类心脏发生过程中异常的血管平滑肌命运决定联系起来。

先天性心脏病（CHD）影响约1%的活产婴儿，其发病机制中非编码基因组元件的功能长期未明。全基因组关联研究显示约93%的疾病相关变异位于非编码区域，但既往研究主要关注活跃染色质中的单核苷酸多态性，对抑制性和 poised 染色质状态中的变异——即基因组的调控"暗物质"——研究甚少，这为识别靶基因、受影响细胞类型及致病机制带来了挑战。为了解决这些问题，研究人员开展了人类心脏发生过程中染色质状态的高维单细胞图谱研究。研究人员改良了CoTECH（转录组与富集染色质结合联合检测）策略，实现了单细胞内组蛋白修饰与基因表达的同步分析，将顺式调控元件分为六种染色质状态，并从8128个非编码新发变异中优先筛选出610个CHD相关非编码新发变异（ncDNV）。对富集于抑制性和二价调控元件中的选定ncDNV进行CRISPR敲入，发现其导致心脏分化缺陷。对与ETS1（ETS原癌基因1）相关的Polycomb标记ncDNV进行分子和细胞解析，发现变异位点周围H3K27me3信号降低、H3K27ac信号升高，同时邻近基因ETS1上调。携带ncDNV的细胞中ETS1上调扭曲了谱系承诺：早期偏向第二心场（SHF）祖细胞，后期倾向于具有增强迁移和重塑能力的血管平滑肌细胞（vSMC）命运。该研究开创了对富集于抑制性和二价区域的CHD相关ncDNV的单细胞多组学解析，将非编码变异与特定染色质状态、靶基因和受扰乱的谱系决定在单细胞分辨率上联系起来，为靶向这些关键元素的CHD治疗策略提供了重要见解。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。研究采用的主要关键技术方法包括：改良CoTECH单细胞多组学技术（同时检测H3K27ac、H3K27me3、H3K4me3和转录组）、CRISPR-Cas9介导的基因组敲入、scRNA-seq、原位ChIP-seq、ChromHMM染色质状态注释、SCENIC⁺增强子驱动基因调控网络构建、VISION metacell分析以及人胚胎干细胞（H9）体外心肌分化模型。研究结果如下：（1）人类心脏分化的联合单细胞ChIP-seq和单细胞RNA-seq图谱构建：研究人员通过对H3K27ac、H3K4me3和H3K27me3的CoTECH分析，在D0、D2、D5、D15和D30共获得20738个高质量细胞，鉴定出11个 distinct 亚群，包括多能干细胞、中胚层祖细胞、心脏中胚层、早期和晚期多能心脏祖细胞（eMCP/LMCP）、早期和晚期心肌细胞（eCM/LCM）、心脏神经嵴细胞、vSMC、心外膜细胞和内皮细胞，并构建了增强子驱动基因调控网络，鉴定了79个eRegulon，验证了ZIC3作为MESP1上游调控因子驱动心脏谱系特化的功能。（2）通过ChromHMM定义LMCP谱系承诺过程中的染色质动态：研究人员利用ChromHMM将染色质注释为六种状态——侧翼TSS（S1）、poised转录（S2）、活跃TSS（S3）、活跃增强子（S4）、抑制性Polycomb（S7）和二价染色质（S8），发现活跃TSS靶向基因表达最高，Polycomb标记基因表达最低；在LMCP向CM或vSMC分化过程中，CM主要获得de novo S4状态，而vSMC建立更多de novo S1状态，表明两种谱系采用不同的染色质协调策略。（3）不同细胞类型中非编码染色质状态富集的CHD-ncDNV分配：研究人员从749例CHD先证者的全基因组测序中筛选出610个ncDNV，发现HTX相关ncDNV主要富集于LMCP和CM的活跃染色质状态S3和S4，而CTA和LOL相关ncDNV优先富集于二价S8区域，部分CHD ncDNV富集于抑制性S7状态。（4）LMCP中优先CHD-ncDNV的功能验证：研究人员将三个S7-ncDNV和一个S8-ncDNV通过CRISPR-Cas9敲入H9 hESCs，发现ETS1_DNV导致邻近基因ETS1和FLI1表达显著升高，LINC_DNV激活XRN2并抑制PAX1，AP1S1_DNV导致AP1S1等基因表达持续降低而SERPINE1上调；ETS1_DNV细胞几乎无法激活所有检测的心脏谱系特异性基因。（5）ETS1_DNV通过促进异常TBX1⁺ SHF和ETS1⁺ vSMC命运 disrupt 心脏谱系承诺轨迹：scRNA-seq分析显示ETS1_DNV细胞在SHF_P-DNV、Epi_Pro和ETS1⁺ vSMC簇中比例增加，而在SHF_P、vSMC和CM簇中减少；D5时TBX1⁺ SHF祖细胞显著富集，D7时上调基因参与间充质发育，后期谱系承诺转向ETS1⁺ vSMC， characterized by 细胞外基质组织和细胞迁移相关基因表达增加。（6）ETS1_DNV hESC中整体H3K27ac和H3K27me3 disruption 构成分化缺陷的基础：原位ChIP-seq显示ncDNV样本丢失约50%的峰同时获得相当数量的新峰，ncDNV位点H3K27me3信号降低伴H3K27ac信号升高；获得H3K27ac和丢失H3K27me3的峰与上皮和间充质功能基因相关，而H3K27me3增加和H3K27ac减少的峰与RNA加工基因相关。（7）上调的ETS1足以且必要重定向ETS1_DNV hESC的心脏分化：约50%的D7上调H3K27ac峰被ETS1占据，这些共结合区域与间充质分化和神经嵴细胞发育基因相关；ETS1通过启动子结合强烈激活Wnt通路基因；Dox诱导的ETS1过表达导致心脏基因下调和迁移性vSMC标志物上调，而ETS1敲低可显著挽救心脏分化并降低vSMC标志物表达。讨论部分总结：非编码基因组因复杂性和系统研究方法的缺乏仍是研究难点。该研究通过改良CoTECH应用于体外心脏分化模型，同时映射三种组蛋白修饰和转录组数据，填补了抑制性/二价元件在人类心脏发生中作用的理解空白，提供了"变异-染色质状态-细胞身份"的见解。研究局限性包括：CoTECH数据来自体外分化细胞，可能无法完全再现体内胎儿心脏发育的复杂性；仅定义六种染色质状态限制了基因组覆盖和CHD相关ncDNV检测灵敏度。尽管如此，突变系中观察到的体外分化缺陷与相应CHD先证者的异常高度平行。对三个优先ncDNV的系统解析揭示了超出预期的复杂致病机制，表达水平较高的基因更可能是CHD表型的因果贡献者。ETS1_DNV细胞中ETS1上调促进早期具有上皮特征的SHF生成，后期导向高重塑潜能的vSMC命运承诺，这与ETS1直接调控细胞外基质成分基因表达的既往报道一致。该研究将ETS1介导的血管病理学范式扩展至CHD的发育起源，双向功能获得和功能缺失实验证明升高的ETS1既是必要的也是充分的驱动vSMC谱系承诺。总之，该研究建立了一个强大的平台，用于在细胞类型分辨率的水平上分析多种染色质状态，为理解复杂胚胎发育过程中非编码基因组关键区域的调控动态提供了框架，为提高诊断准确性和精准治疗提供了关键见解。研究结论翻译：该工作建立了一个用于解释非编码CHD风险变异的单细胞染色质状态框架，并揭示了一个由ETS1驱动的程序，将Polycomb失调的非编码变异与人类心脏发生过程中异常的血管平滑肌命运决定联系起来。