《Horticulturae》：Genome-Wide Identification and Expression Profiling of HD-ZIP Transcription Factor Family in Poncirus trifoliata Under Phytohormone and Abiotic Stress Treatments
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本研究在基因组水平上鉴定了枫树（Poncirus trifoliata (L.) Raf.）中的34个HD-ZIP基因，并进行了全面的生物信息学分析。进一步确定了PtrHB基因在六种植物激素（ABA、SA、JA、BR、ETH、GA）和两种非生物胁迫（脱水、低温
本研究在基因组水平上鉴定了枫树（Poncirus trifoliata (L.) Raf.）中的34个HD-ZIP基因，并进行了全面的生物信息学分析。进一步确定了PtrHB基因在六种植物激素（ABA、SA、JA、BR、ETH、GA）和两种非生物胁迫（脱水、低温）处理下的表达谱。系统发育分析将所有PtrHB蛋白划分为四个不同的亚家族（I–IV），其结构域组成高度保守，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中已建立的分类系统一致。片段重复被揭示为PtrHB家族扩张的主要驱动力，同时检测到三次串联重复事件。启动子顺式元件分析揭示了激素和胁迫响应元件在亚家族特异性分布。研究重点突出了几个对特定刺激响应显著的候选基因，包括PtrHB32（受脱水、低温和ABA强烈诱导）、PtrHB15（JA响应）和PtrHB16（SA响应）。综上所述，本研究首次对枫树中HD-ZIP转录因子家族进行了系统的全基因组分析，为该家族的进化扩张和功能分化提供了有价值的见解。研究结果也为候选胁迫调控基因的功能验证和耐胁迫柑橘砧木的分子育种奠定了理论基础。
枫树HD-ZIP转录因子家族：全基因组鉴定与胁迫响应表达谱的系统研究
一、研究背景与科学问题
枫树（Poncirus trifoliata，2n = 2x = 18）属于芸香科（Rutaceae）枳属，对低温、干旱和盐胁迫等多种非生物胁迫表现出高度抗性。由于其与柑橘种质资源亲缘关系密切且嫁接亲和性强，枫树被广泛用作柑橘生产的砧木，以提升整体植株的胁迫耐受性和果实产量。因此，解析枫树非生物胁迫响应的分子机制，对柑橘抗逆育种和栽培实践具有重要的指导意义。
同源异型域-亮氨酸拉链（HD-ZIP）家族是一类植物特有的转录因子，其典型特征为含有负责DNA结合的保守同源异型域（HD）和介导蛋白二聚化的亮氨酸拉链（LZ）结构域。HD-ZIP蛋白在从苔藓到被子植物的大多数植物物种中序列高度保守，大量证据表明其参与植物生长发育和胁迫适应等多种生物学过程。在大多数植物物种中，HD-ZIP家族根据序列同源性和结构域组成被划分为四个亚家族（I–IV）。HD-ZIP I亚家族主要响应外界环境信号，广泛参与非生物胁迫响应；HD-ZIP II亚家族呈现较强的组织特异性表达，主要受光信号调控；HD-ZIP III亚家族主要调控维管组织模式形成、侧器官极性和厚壁组织形成；HD-ZIP IV亚家族主要与表皮器官发育、毛状体形成和色素生物合成相关。
植物激素作为植物生命活动的核心调控因子，与HD-ZIP转录因子之间存在广泛的交叉对话，形成复杂的调控网络。在逆境条件下，HD-ZIP与激素的互作通路发生特异性重编程，成为介导植物胁迫耐受的核心模块。然而，此前对枫树HD-ZIP家族缺乏系统性的研究，其家族成员的全基因组鉴定、进化特征及在激素和胁迫条件下的表达动态尚不清楚。
二、研究内容与主要结论
本研究利用枫树高质量完整参考基因组，通过多步骤生物信息学流程系统鉴定了34个HD-ZIP家族基因（PtrHB1–PtrHB34），并对其理化性质、基因结构、染色体分布等进行了全面分析。进一步通过qRT-PCR技术，检测了PtrHB基因在六种外源植物激素（ABA、SA、JA、BR、ETH、GA）和两种非生物胁迫（脱水和低温）处理下的表达模式，筛选出多个胁迫响应候选基因。该研究为枫树HD-ZIP转录因子的功能机制研究提供了理论基础，也为耐胁迫柑橘砧木的遗传改良提供了分子工具。
三、关键技术方法
研究人员采用了多步骤生物信息学流程鉴定HD-ZIP基因家族成员：首先利用隐马尔可夫模型（HMM）对保守结构域（Pfam登录号：PF00046和PF02183）进行全蛋白质组扫描，结合BLASTp比对和NCBI CDD、SMART数据库验证，最终确定34个非冗余基因。系统发育分析采用MEGA X构建最大似然（ML）树，共线性分析使用MCScanX，Ka/Ks值计算采用TBtools的YN模型。顺式作用元件预测使用PlantCARE数据库。表达分析采用qRT-PCR技术，以PtrActin为内参基因，使用2?ΔΔCt方法计算相对表达量。植物材料为江西农业大学温室培养的枫树幼苗，共选取96株生长一致的幼苗进行激素和胁迫处理，每个处理和时间点设置三个独立生物学重复。
四、研究结果
4.1 枫树基因组中HD-ZIP基因的鉴定
研究人员从枫树基因组中鉴定出34个非冗余HD-ZIP基因，命名为PtrHB1至PtrHB34。所有PtrHB蛋白的氨基酸长度从167 aa到1410 aa不等，分子量跨度从18.98 kDa到155.52 kDa。这种显著的异质性与其亚家族特异性的结构域组成密切相关：III亚家族和IV亚家族成员在HD-ZIP核心区域下游携带额外的START结构域和SAD结构域，其中III亚家族成员还具有C端MEKHLA基序。所有PtrHB蛋白均为亲水性蛋白，GRAVY值范围为?1.122至?0.107。
4.2 枫树与拟南芥HD-ZIP基因的系统发育分析
系统发育分析显示，枫树的34个PtrHB蛋白与甜橙（Citrus sinensis）和拟南芥的HD-ZIP成员清晰聚类为四个亚家族（I–IV），与拟南芥HD-ZIP家族的经典分类系统完全一致。枫树与拟南芥的大多数基因形成直系同源对，在III亚家族和I亚家族中最为严格。值得注意的是，枫树中鉴定出8个II亚家族成员，而甜橙仅报道2个，这种差异部分归因于基因组组装版本和基因预测流程的差异，也可能与枳属和柑橘属进化分化过程中的谱系特异性基因重复有关。Ka/Ks分析显示，片段重复基因对均呈现Ka/Ks < 1，表明HD-ZIP家族在双子叶植物进化过程中经历了强烈的纯化选择。
4.3 HD-ZIP基因家族的基因结构、保守基序和结构域分析
通过MEME Suite鉴定出10个保守基序。基序1和基序2位于HD结构域，基序3分布于亮氨酸拉链区域，所有家族成员均含有这三个基序。基序4、5、6位于START结构域，基序8位于SAD结构域，这些基序广泛存在于III和IV亚家族成员中。基因结构在同一亚家族内相似，但亚家族间差异显著：I和II亚家族成员主要含3–4个外显子和2–3个内含子，而III亚家族所有成员含18个外显子，IV亚家族多数成员含10个外显子。
4.4 PtrHBs启动子顺式作用元件分析
研究人员提取了每个PtrHB基因起始密码子上游2000 bp的启动子序列，利用PlantCARE数据库预测顺式作用元件。共筛选出9类与激素信号和环境胁迫相关的顺式元件。ABA响应元件、MeJA响应元件和SA响应元件在大多数PtrHB启动子中高度丰富，而低温响应（LTR）元件仅存在于部分启动子中。MYB和MYC结合基序存在于除PtrHB23和PtrHB24外的所有家族成员启动子中。防御和胁迫响应元件、GA响应元件和生长素响应元件的分布与亚家族分类相关：II亚家族基因启动子基本缺乏这三类元件，而I亚家族启动子中广泛分布。
4.5 PtrHBs的基因组内和基因组间共线性分析
MCScanX分析显示，在分布于9条染色体的34个PtrHB基因中，共鉴定出8个片段重复事件涉及9个PtrHB基因，这些基因均嵌入基因组中的大型共线性区块。串联重复方面，鉴定出2个独立的串联重复簇含4个PtrHB基因：PtrHB19和PtrHB20在4号染色体上首尾相邻排列，PtrHB23和PtrHB24在5号染色体上形成紧密串联基因簇。片段重复是枫树HD-ZIP家族扩张的主要驱动力，串联重复起补充作用。种间共线性分析显示，枫树与拟南芥之间存在43个共线性基因对，在3号和7号染色体上富集最明显；与单子叶植物水稻相比仅检测到20个共线性对，但3号染色体仍排名第一，表明该染色体上的HD-ZIP基因位点在单子叶和双子叶分化之前就保留了祖先共线性关系。
4.6 PtrHBs在激素处理下的表达谱
在ABA处理下，PtrHB22、PtrHB23和PtrHB32显著上调，其中PtrHB23呈持续上升趋势，24 h时达到4.3倍；而PtrHB12和PtrHB17等大量家族成员被下调。SA处理下，PtrHB16表现出最显著的诱导，12 h时上调8.7倍；PtrHB15、PtrHB30和PtrHB21也被显著诱导，峰值表达为4.5至5.2倍。JA处理下，PtrHB15响应最强，3 h时快速上调10.1倍并维持高表达水平；PtrHB13也被持续诱导。BR处理在所有激素处理中诱导了最广泛的上调，尤其对III和IV亚家族成员，PtrHB13、PtrHB14、PtrHB16、PtrHB25和PtrHB34在9 h时均表现出6.6至9.8倍的强烈诱导。ETH处理呈现明显的时间特异性响应模式，9 h时超过半数检测基因被上调，PtrHB34和PtrHB25分别达到8.39倍和8.15倍；而PtrHB2、PtrHB8、PtrHB18、PtrHB26和PtrHB32整体呈持续抑制趋势。GA处理下，PtrHB13被快速强烈诱导，3 h时达到4.8倍并维持至24 h；PtrHB11和PtrHB27也显著上调。
4.7 PtrHBs在胁迫处理下的表达谱
脱水处理下，11个PtrHB基因持续上调，14个基因在处理后期显著下调。PtrHB32诱导最强，24 h时表达量增加18.4倍；PtrHB4、PtrHB11和PtrHB15也持续上调，峰值表达为2.7至6.1倍。PtrHB12、PtrHB17、PtrHB21和PtrHB33则被急剧抑制，12–24 h时相对表达量降至0.1倍以下。低温胁迫下，显著诱导的基因数量相对有限，与LTR元件在家族中的限制性分布一致。PtrHB32在9–12 h出现瞬时强烈诱导，最大倍数为13.4；PtrHB6和PtrHB16也在6 h时分别达到3.2倍和3.8倍的上调。这三个基因的启动子区域均至少含有一个LTR元件。大多数家族成员在长期低温处理下呈下调趋势，PtrHB33、PtrHB12和PtrHB19在24 h时转录水平降至对照的0.3倍以下。
五、讨论与结论
讨论部分指出，34个枫树HD-ZIP基因划分为四个亚家族，与拟南芥经典分类系统完全一致，表明该家族的主要亚功能化发生在真双子叶植物谱系分化之前。片段重复驱动的家族扩张可能源于古老的真双子叶植物γ三倍化事件，而串联重复簇可能代表更近期、局部适应的扩张。启动子顺式元件的亚家族特异性分布为功能分化提供了线索：I亚家族启动子富含防御和胁迫、GA和生长素响应元件，而II亚家族基本缺乏这些元件。研究重点关注的候选基因中，PtrHB32是最强的非生物胁迫响应候选基因，受脱水、低温和ABA高度诱导而受乙烯抑制，与拟南芥AtHB21/AtHB40/AtHB53直系同源，提示其可能具有保守的ABA依赖性正调控作用。PtrHB15和PtrHB16可能位于SA和JA信号交汇处，分别对JA和SA表现出差异敏感性。BR对III/IV亚家族成员的广泛强烈诱导表明该调控模块在枫树中保守。研究也指出，功能推断基于直系同源关系和相关性表达数据，仍需通过过表达、基因编辑、蛋白-DNA互作分析和全基因组靶标鉴定等直接实验验证。
研究结论为：从枫树基因组中全面鉴定出34个HD-ZIP家族基因（PtrHB1–PtrHB34）。生物信息学分析表明这些基因分为四个保守亚家族，具有不同的理化性质、基因结构和顺式元件分布。在PtrHB家族扩张过程中检测到片段重复和串联重复事件，3号染色体上的HD-ZIP基因位点在真双子叶植物中保持保守的祖先共线性关系。在六种外源植物激素以及脱水和低温胁迫下的表达谱分析鉴定出多个胁迫响应候选基因。其中，PtrHB32受脱水、低温和ABA强烈诱导，PtrHB15主要响应JA，PtrHB16表现出显著的SA响应性。该研究为枫树HD-ZIP基因的未来研究提供了基础资源，对这些候选基因的进一步功能验证可能支持耐胁迫柑橘砧木的遗传改良。
