不同水分可利用水平下番茄幼苗对真菌接种的生长、生化及基因表达响应

《Horticulturae》：Growth, Biochemical, and Gene-Expression Responses of Tomato Seedlings to Fungal Inoculation Under Different Water-Availability Levels

　　

水分亏缺可改变植物生长及与胁迫相关的生化和分子响应。研究人员从Pinus cembroides根系中分离获得4株真菌——Cadophora sp.、Phialophora livistonae、Pochonia sp.和Pochonia chlamydosporia，并在递增的聚乙二醇（PEG-6000）浓度下进行体外评价。随后选取Pochonia sp.和P. livistonae，对生长于基质持水量100%、75%、50%或25%条件下的番茄幼苗进行接种。采用析因分析评价幼苗生长、根和叶生化性状、抗氧化酶活性以及5个水分亏缺相关基因的表达。在各PEG-6000处理中，Pochonia sp.均保持最大菌落直径；而在20% PEG-6000下，Pochonia sp.和P. livistonae产生的真菌鲜生物量最高。灌溉水平显著影响大多数幼苗生长性状。真菌接种总体上显著影响根鲜重和干重，但水平内比较仅在轻度水分胁迫（75%）下发现P. livistonae接种幼苗的根鲜重高于未接种幼苗。相同条件下，P. livistonae较未接种对照和Pochonia sp.降低了根脯氨酸含量。根过氧化氢酶活性表现出显著的接种×灌溉互作，而总酚含量和叶抗氧化酶活性未显示显著处理效应。灌溉显著影响Fe-SOD基因表达，但真菌接种对所评价的任何基因均无显著影响；经Holm校正后，所有计划接种对比均不显著。这些结果表明，番茄对真菌接种的响应具有选择性且主要与根相关，而非对生长或水分亏缺耐受性的一致增强。后续工作应验证真菌定殖情况，并在生产条件下评估植株水分状况和表现。

本研究围绕从松树（Pinus cembroides）根系分离的内生真菌对番茄（Solanum lycopersicum L.）幼苗在水分亏缺条件下的调控作用展开。研究背景在于，气候变化导致的降水格局改变和干旱频发对农业生产构成日益严重的威胁，水分可利用性下降会引起植物光合作用、气孔导度和气体交换降低，并导致活性氧（ROS）积累，当ROS产生超过抗氧化能力时即造成氧化损伤。番茄是全球最重要的园艺作物之一，2024年产量超过1.88亿吨，其果实富含多酚和类胡萝卜素等营养与抗氧化化合物，但番茄需水量较大且许多商业品种对干旱敏感，因此寻找改善番茄对有限水分可利用性响应的生物策略具有重要意义。内生真菌可在不引起明显病害症状的情况下定殖于健康植物内部组织，已有研究表明植物—内生真菌关联可通过调节生长素、赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等植物激素、养分动员以及脯氨酸等相容性溶质积累来缓解水分亏缺影响，并可修饰植物水分关系、激活包括过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶在内的抗氧化防御机制。已有研究报道Pochonia chlamydosporia可促进番茄和莴苣生长并具有杀线虫活性，Cadophora sp.菌株对甜瓜镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有拮抗作用，Phialophora mustea接种可改善番茄在金属胁迫下的生长和耐受性。尽管P. cembroides与番茄系统发育距离较远，但内生真菌与不同宿主互作的能力并不必然受原始宿主分类身份限制，已有研究证明来自非番茄宿主的内生真菌可定殖番茄根系并影响生长和养分获取。然而，关于Cadophora sp.、Phialophora livistonae和Pochonia属真菌对处于不同强度水分亏缺下番茄形态、生化、抗氧化和分子响应的影响信息有限，来自系统发育远缘宿主的内生真菌调控园艺作物水分亏缺响应的潜力也鲜有探索。研究人员据此提出假设：接种从P. cembroides根系获得的选择性真菌分离株可调控番茄幼苗在不同水分可利用水平下的形态、生化、抗氧化和分子响应，且响应取决于真菌身份和水分亏缺强度。研究得出，4株真菌对PEG-6000的体外响应存在差异，Pochonia sp.在各浓度下菌落直径最大，Pochonia sp.和P. livistonae在20% PEG-6000下鲜生物量较高；在番茄幼苗中，水分可利用性对生长和生化响应的影响比真菌接种更为一致，接种总体上显著影响根鲜重和干重，最明确的灌溉水平内效应是轻度水分胁迫下P. livistonae较未接种对照增加根鲜重，该处理还表现出较低的根脯氨酸含量，根CAT活性存在显著的接种×灌溉互作，但未建立在茎生物量、总酚含量或抗氧化酶活性上一致的接种相关增加；灌溉显著影响Fe-SOD基因表达，而真菌接种对5个评价基因的表达均无显著影响，Holm校正后无计划接种对比保持显著。因此，结果支持选择性的、菌株和性状依赖的响应，但未证明水分亏缺耐受性改善或明确的分子机制。其重要意义在于细化了原始假设，表明真菌响应具有性状特异性，并不必然转化为水分亏缺耐受性的广泛改善，同时提示后续研究应验证真菌定殖、直接测定植株水分状况，并在更高生物学重复和更长周期或生产条件下评估这些响应。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：在墨西哥Coahuila和Nuevo León两州10个P. cembroides样地（每样地1.0 ha，随机选取20株间隔至少8 m的树，距树干基部约1.5 m挖掘采集根尖并混合为复合样品）采集根系并分离内生真菌；通过组织表面消毒、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养和ITS区域引物ITS1/ITS4的PCR扩增、测序及BLAST比对进行分子鉴定；采用PEG-6000固体培养基（10%、15%、20%，标称渗透势约?0.2、?0.4、?0.6 MPa）和液体Czapek Dox培养基（5%、10%、15%、20%）进行体外渗透胁迫评价，测定菌落直径和鲜生物量；采用3×4析因设计（接种3水平：未接种绝对对照AC、P. livistonae、Pochonia sp.；水分4水平：基质持水量100%、75%、50%、25%）在生物气候室中进行幼苗试验；测定生长与生物量变量；采用Folin–Ciocalteu法测定总酚含量、茚三酮法测定脯氨酸含量、Bradford法测定总蛋白、基于H₂O₂消耗测定CAT活性、基于谷胱甘肽消耗测定谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性；采用RT-qPCR（2^?ΔΔCt法，ACT为内参基因）分析NCED1、PIP2、ERD15、PAL5-3和Fe-SOD基因表达；使用R软件进行双因素方差分析、Tukey HSD检验及Holm多重比较校正。

研究结果如下。3.1 内生真菌的分子鉴定：通过ITS区域序列分析鉴定出从P. cembroides根系分离的4株内生真菌，即Pochonia sp.（SJ10504）、Cadophora sp.（CA2-1602）、Phialophora livistonae（CO8-1402）和Pochonia chlamydosporia（M2-2804），与GenBank条目序列一致性为98%—99.65%，序列覆盖度为79%—98%。3.2 体外渗透胁迫耐受性：在固体培养基试验中，培养30天后Pochonia sp.在所有评价的PEG-6000浓度下均表现最大菌落直径；在无PEG-6000和10%条件下P. chlamydosporia菌落直径显著低于其他分离株；在20% PEG-6000下Cadophora sp.、P. livistonae和P. chlamydosporia菌落直径统计相似且均显著低于Pochonia sp.；双因素方差分析显示真菌分离株与PEG-6000浓度存在显著互作（F_(9,32)=18.02，p<0.001）。相对菌落生长分析显示Pochonia sp.在各浓度下保持相对稳定（为对照的96.7%—100.9%），而P. chlamydosporia在20% PEG-6000下相对菌落直径增至188.2%，但该响应需谨慎解释。在液体培养基中，无PEG-6000时4株真菌生物量无显著差异；在20% PEG-6000下P. livistonae和Pochonia sp.产生最大生物量且二者无显著差异。3.3 内生真菌和水分可利用性对番茄幼苗生长和生物量的影响：水分可利用性显著影响茎直径（p<0.0001）、株高（p<0.0001）、叶片数（p=0.0014）、根长（p<0.0001）、根鲜重（p=0.0246）、茎鲜重（p<0.0001）和茎干重（p<0.0001），而根干重不受灌溉水平显著影响（p=0.0543）；真菌接种对根鲜重（p=0.0065）和根干重（p=0.0214）有显著主效应，茎直径（p=0.0436）和根长（p=0.0486）存在显著接种×灌溉互作。Tukey HSD比较显示各灌溉水平内接种处理在茎直径、株高、叶片数、根长、根干重、茎鲜重和茎干重上均无显著差异；轻度水分胁迫下P. livistonae接种幼苗根鲜重显著高于未接种幼苗，Pochonia sp.为中间响应；严重水分胁迫下P. livistonae接种幼苗根鲜重显著高于Pochonia sp.接种幼苗，而未接种对照为中间值。总体而言，水分可利用性降低伴随生长和生物量下降，但真菌接种效应因变量而异，未在评价的水分水平上证明幼苗生长或生物量积累的一致改善。3.4 内生真菌和水分可利用性对脯氨酸和总酚含量的影响：真菌接种对叶脯氨酸含量有显著主效应（p=0.0367），而灌溉水平（p=0.1386）和互作（p=0.4523）不显著，但各灌溉水平内接种处理间叶脯氨酸无显著差异；根脯氨酸含量受真菌接种（p=0.0013）、灌溉水平（p=0.0179）及其互作（p=0.0038）显著影响，轻度水分胁迫下P. livistonae接种幼苗根脯氨酸含量显著低于未接种和Pochonia sp.接种幼苗；总酚含量在叶和根中均未显示真菌接种、灌溉水平或互作的显著效应（p>0.05）。3.5 内生真菌和水分可利用性对总蛋白含量和抗氧化酶活性的影响：叶总蛋白含量无显著处理效应；根总蛋白含量受灌溉水平显著影响（p=0.0106），而真菌接种（p=0.1297）和互作（p=0.3183）不显著；叶CAT活性无显著主效应或互作；根CAT活性受灌溉水平（p=0.0059）和接种×灌溉互作（p=0.0027）显著影响，而接种主效应不显著（p=0.1097），表明根CAT活性对真菌接种的响应取决于水分可利用性；叶GPX活性无显著效应，根GPX活性受灌溉水平显著影响（p=0.0054），而接种（p=0.8140）和互作（p=0.1880）不显著。3.6 内生真菌和水分可利用性对胁迫响应相关基因表达的影响：对5个胁迫响应相关基因（NCED1、PIP2、ERD15、PAL5-3和Fe-SOD）在番茄叶片中的相对表达进行log₂转换后的双因素方差分析，未检测到真菌接种对任何基因的显著主效应（p>0.05），接种与灌溉水平互作对任何基因也不显著（p>0.05）；灌溉水平显著影响Fe-SOD表达（p=0.0356），而对NCED（p=0.7314）、PIP2（p=0.5827）、ERD15（p=0.2109）和PAL5-3（p=0.6118）无显著灌溉效应；计划对比显示40个比较在Holm校正后均不显著（校正p>0.05），其中严重水分胁迫下Pochonia sp.接种伴随PAL5-3和Fe-SOD相对表达数值上较低，但未达统计显著（PAL5-3校正p=0.1149；Fe-SOD校正p=0.3363）。

讨论部分总结：本研究揭示了真菌分离株对PEG-6000生长响应的差异，并表明真菌接种和水分可利用性与番茄幼苗选择性的形态和生化响应相关，但统计分析不支持接种真菌对生长、抗氧化保护或胁迫响应基因表达的普遍增强；可检测的接种相关效应局限于特定根性状和脯氨酸响应，而灌溉水平解释了生长和若干根生化变量的大部分变异，这些发现细化了原始假设，表明真菌响应具有性状特异性且不必然转化为水分亏缺耐受性的广泛改善。固体培养基试验中Pochonia sp.在各浓度下菌落直径最大，分离株×PEG-6000显著互作表明菌落生长响应取决于真菌身份；液体培养基中Pochonia sp.和P. livistonae在20% PEG-6000下鲜生物量最高；但渗透势为标称值而非实测值、PEG覆盖可能影响固体培养基性质、鲜生物量同时反映组织含水量和真菌生长，因此结果支持选择两个分离株进一步测试，而非预测其体内功效，体外PEG耐受性与改善番茄水分亏缺耐受性之间未建立直接关系。水分可利用性是番茄幼苗生长的主导决定因素，接种对根鲜重和干重有显著总体效应，但灌溉水平内比较仅根鲜重存在明确接种相关差异，提示对根鲜生物量的选择性效应而非全株生长的一致刺激，且鲜重不能单独确立更大的根结构生物量或改善的水分获取。脯氨酸积累呈更特异性响应，轻度水分胁迫下P. livistonae接种幼苗根脯氨酸低于未接种和Pochonia sp.接种幼苗，但脯氨酸浓度也反映合成、周转和代谢利用，降低不能等同于耐受性改善或更高胁迫敏感性。与早期描述性模式提示的解释相反，总酚含量在叶和根中均不受接种、灌溉或互作显著影响，数值差异应视为描述性变异而非苯丙烷途径激活的证据。抗氧化测定进一步强调组织特异性响应，叶总蛋白和CAT、GPX活性无显著效应，根CAT活性存在显著互作但未确立哪个真菌处理在各灌溉水平内显著不同于相应对照，且未直接测定ROS积累或氧化损伤，不能声称氧化损伤减少。基因表达结果需更谨慎解释，双因素方差分析未检测到真菌接种显著主效应和互作，数值表达模式不能呈现为Pochonia sp.或P. livistonae统计学证明的诱导或抑制，灌溉显著影响Fe-SOD表达提示该抗氧化响应网络组分对水分处理敏感，但总体灌溉效应既不确立对递增水分限制的单调响应，也不涉及真菌接种，计划对比经Holm校正后不显著，表达仅在单一采样时间测定，可能错过瞬时转录响应，且转录本丰度本身不能确立相应生理或生化途径的活性。综上，形态、生化和分子数据集表明对减少灌溉的响应比真菌接种响应更一致，最明确的接种相关观察是轻度水分胁迫下P. livistonae增加根鲜重、相同条件下降低根脯氨酸以及影响根CAT活性的显著互作，这些发现可推动对根局部响应的进一步研究，但未证明改善干旱耐受性的协调机制。方法学局限包括：表面消毒有效性未独立验证，内生起源尚待确证；接种后番茄根系定殖未经显微镜、再分离或分子检测确认，观察到的关联不能明确归因于已建立的内生定殖；灌溉制度为标称的基质持水量分数且每四天调整一次，事件间可能存在水分波动，未测定叶水势、相对含水量、气体交换等直接生理指标；生化和基因表达分析每处理仅3个独立混合生物学重复，限制了解析可变分子响应的功效。未来研究应验证定殖、直接量化植株水分状况、增加生物学重复并在多时间点采样。研究结论翻译如下：4株真菌对PEG-6000的体外响应存在差异，Pochonia sp.在评价的各浓度下菌落直径最大，Pochonia sp.和Phialophora livistonae在20% PEG-6000下产生相对较高的鲜生物量。在番茄幼苗中，水分可利用性对生长和生化响应的影响比真菌接种更一致。尽管接种总体上显著影响根鲜重和干重，但其最明确的灌溉水平内效应是轻度水分胁迫下P. livistonae较未接种对照增加根鲜重，该处理还表现出较低的根脯氨酸含量，而根过氧化氢酶活性表现出显著的接种×灌溉互作。未建立在茎生物量、总酚含量或抗氧化酶活性上一致的接种相关增加。灌溉显著影响Fe-SOD基因表达，但真菌接种对5个评价基因的表达无显著影响，且多重比较校正后无计划接种对比保持显著。因此，结果支持选择性的、菌株和性状依赖的响应，但未证明水分亏缺耐受性改善或明确的分子机制。未来研究应验证真菌定殖、直接测定植株水分状况，并在更高生物学重复和更长周期或生产条件下评价这些响应。