《Current Issues in Molecular Biology》：Taiwanoid A Inhibits Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) Progression Through EGFR-Associated Signaling
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口腔鳞状细胞癌（OSCC）仍是全球重大健康挑战，有效治疗选择有限。本研究从Taiwania cryptomerioides中分离二萜类化合物，并评估其对OSCC的抗癌活性。经MPLC、HPLC和NMR分析鉴定出10种二萜类化合物，其中taiwanoid A对C
口腔鳞状细胞癌（OSCC）仍是全球重大健康挑战，有效治疗选择有限。本研究从Taiwania cryptomerioides中分离二萜类化合物，并评估其对OSCC的抗癌活性。经MPLC、HPLC和NMR分析鉴定出10种二萜类化合物，其中taiwanoid A对CAL27细胞表现出最强的抑制作用。功能实验表明，taiwanoid A以剂量依赖方式显著抑制细胞增殖、迁移、侵袭、肿瘤细胞管状结构形成和集落形成，同时促进细胞凋亡。转录组分析和Western blotting显示，taiwanoid A调控Wnt/β-catenin相关、MAPK和PI3K-AKT信号通路。靶点预测、分子对接和细胞热位移实验确定EGFR为taiwanoid A的潜在靶点。此外，EGFR敲低减弱了taiwanoid A对下游信号和恶性细胞行为的抑制作用，表明其抗癌活性部分依赖于EGFR相关信号抑制。体内异种移植实验进一步证实，taiwanoid A有效抑制CAL27肿瘤生长。综上，这些发现支持taiwanoid A具有显著的抗OSCC活性，并提示EGFR相关信号通路参与该活性，凸显其作为口腔癌有前景的治疗候选物的潜力。
研究背景：口腔鳞状细胞癌（OSCC）约占全球口腔恶性肿瘤的90%，常见于舌、颊黏膜、牙龈和口底，易经淋巴系统转移。据GLOBOCAN 2022统计，2022年全球唇及口腔癌新发约389,846例、死亡188,438例，男性占发病的三分之二以上；全球疾病负担估计显示口腔癌发病率持续上升，尤其在东南亚和中等社会人口指数地区。OSCC发生发展与外部刺激、分子改变和免疫状态等多因素相关，吸烟和饮酒是最常见原因。现有治疗主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗，但广泛手术切除可能损害言语、吞咽、面部外观和心理健康，放化疗常伴明显毒性和耐药，局部复发、颈部淋巴结转移及晚期患者反应有限仍是主要临床挑战，亟需新的有效治疗药物。表皮生长因子受体（EGFR）在OSCC中常过表达，与肿瘤细胞增殖、侵袭、淋巴结转移、不良预后及放化疗耐药相关，是重要治疗靶点；靶向EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗（Cetuximab）用于局部晚期或复发/转移性头颈部鳞状细胞癌，但缓解率低且易发生原发或获得性耐药，替代受体酪氨酸激酶及RAS–RAF–MEK–ERK、PI3K–AKT–mTOR、JAK–STAT等下游通路激活可能参与耐药。因此，寻找能调控EGFR信号的新型天然化合物可能为OSCC提供新治疗机会。天然产物结构多样、毒性较低，是抗癌药物开发的重要来源，紫杉醇、喜树碱及其衍生物、雷帕霉素等均为成功范例。从Taiwania cryptomerioides分离的化合物已显示细胞毒和抗炎等活性，但抗OSCC潜力研究不足；该植物分布于台湾、湖北、贵州和云南，含二萜、倍半萜、木脂素和精油等成分，具抗多药耐药、细胞毒、抗炎、阻断电压门控K+通道和抗螨等活性。本研究从该植物分离的10种化合物中，taiwanoid A对OSCC细胞抑制活性最强，但其直接分子靶点和抗肿瘤机制尚不清楚，故旨在确定taiwanoid A是否通过靶向EGFR并调控其下游信号通路发挥抗OSCC作用。
研究内容与结论：研究人员从Taiwania cryptomerioides枝叶的甲醇提取物乙酸乙酯层中分离鉴定10种二萜类化合物（1–10），以CAL27为代表性OSCC模型开展机制和功能实验。结果发现taiwanoid A（化合物8）对CAL27细胞抑制最强，IC50为34.84 μM；其以剂量依赖方式抑制增殖、DNA复制、集落形成、肿瘤细胞管状结构形成、侵袭和迁移，并促进凋亡。转录组分析显示635个基因上调、1305个基因下调，GO和KEGG富集集中于MAPK、Wnt和PI3K-AKT通路；Western blotting证实taiwanoid A降低PI3K、AKT、ERK、P38磷酸化水平及β-catenin Ser552磷酸化。靶点预测与DARTS-LC–MS/MS交集得到EGFR和ANXA5，分子对接显示taiwanoid A与EGFR结合能?8.45 kcal/mol、亲和力强于ANXA5，细胞热位移实验（CETSA）支持其与EGFR的细胞靶点结合；taiwanoid A还降低EGFR mRNA及总EGFR蛋白和p-EGFR/EGFR比值。EGFR敲低后，taiwanoid A对β-catenin、PI3K–AKT和MAPK通路蛋白及迁移、增殖、侵袭、集落形成的额外抑制作用消失，提示其作用与EGFR相关信号有关。体内CAL27异种移植实验中，taiwanoid A（20 mg/kg/天，腹腔注射21天）显著抑制肿瘤生长且未明显降低体重，免疫组化显示EGFR、P-AKT、P-ERK、P-P38和P-PI3K阳性细胞比例显著降低。研究结论为：taiwanoid A通过EGFR相关机制调控下游MAPK/PI3K-AKT通路及β-catenin相关信号，抑制细胞迁移、侵袭、增殖、集落形成和肿瘤细胞管状结构形成，最终影响肿瘤生长和恶性进展，支持其作为OSCC治疗候选物进一步开展临床前评价。
关键技术方法：研究人员采用MTT法检测细胞活力并计算IC50；以EdU掺入、集落形成、Transwell、划痕愈合和3D培养（Matrigel管状结构形成）实验评估增殖、侵袭、迁移和管状结构形成；用流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）检测凋亡；对taiwanoid A处理24 h的CAL27细胞进行RNA测序及转录组分析（每组3个生物学重复，数据存于NCBI SRA，BioProject PRJNA1544736）；以Western blotting验证通路蛋白；用PharmMapper靶点预测、DARTS联合LC–MS/MS、分子对接、CETSA和shEGFR敲低实验确定并验证靶点；建立BALB/c-nude小鼠CAL27皮下异种移植模型（每组n=5）并进行免疫组化（IHC）检测。细胞系CAL27、A549和PANC-1购自上海富衡生物，植物样本由昆明植芬生物科技有限公司于2020年10月采集并鉴定。
研究结果：（1）化合物1–10的结构鉴定：获得并鉴定10种二萜类化合物，包括ferruginol（1）、sugiol（2）、13,14-dihydroxy-8,11,13-podocarpatrien-7-one（3）、1β,14-dihydroxy-13-methoxy-8,11,13-podocarpatriene（4）、6β,7α-dihydroxyroyleanone（5）、horminone（6）、4S,5R,9S,10R-8(17),12,14-labdantrien-18-oic acid（7）、taiwanoid A（8）、taiwaniadduct C（9）和taiwaniadduct D（10）。（2）taiwanoid A在体外抑制CAL27细胞恶性行为并促进凋亡：MTT显示taiwanoid A对CAL27抑制最强，IC50为34.84 μM；5、10、20 μM处理以剂量依赖方式抑制增殖和EdU阳性率、集落形成、管状结构形成、侵袭和迁移，流式细胞术显示凋亡呈时间和浓度依赖性增加；4和8 h短时划痕实验也显示残留创面面积显著增大。（3）taiwanoid A调控CAL27细胞MAPK、Wnt和PI3K-AKT通路：转录组显示差异表达基因富集于MAPK、Wnt和PI3K-AKT通路；Western blotting证实PI3K、AKT、ERK、P38磷酸化及β-catenin Ser552磷酸化降低，与AKT驱动β-catenin信号下调一致。（4）EGFR是taiwanoid A抗口腔癌作用的潜在靶点：靶点预测与DARTS交集为EGFR和ANXA5，两者在TCGA HNSC中均高表达；分子对接显示taiwanoid A与EGFR结合更强（?8.45 kcal/mol）；DARTS/MS定量显示taiwanoid A处理后EGFR LFQ强度较对照提高1.12倍（配对t检验未校正p=0.0358）；CETSA显示taiwanoid A保护EGFR免受热降解；GSEA显示EGFR_UP.V1_DN基因集显著负富集；RNA-seq和Western blotting显示EGFR mRNA、总EGFR蛋白及p-EGFR/EGFR比值浓度依赖性降低。（5）EGFR相关信号介导taiwanoid A对口腔癌细胞信号和恶性行为的作用：shEGFR敲低后，taiwanoid A对β-catenin、PI3K–AKT和MAPK通路蛋白及迁移、增殖、侵袭、集落形成均无额外显著影响，提示其作用与EGFR相关信号相关。（6）taiwanoid A抑制CAL27异种移植瘤生长：20 mg/kg/天治疗21天显著抑制肿瘤体积和重量，体重无明显下降；IHC显示EGFR、P-AKT、P-ERK、P-P38和P-PI3K阳性细胞比例显著降低。
讨论与结论：讨论指出，Taiwania cryptomerioides提取物对多种恶性肿瘤细胞有抗增殖作用，如Taicrypnacids A和B对乳腺癌MCF-7、结肠癌HCT-116和骨肉瘤U-2OS有细胞毒活性，6,7-dehydroroyleanone对肝癌HepG2有细胞毒并促凋亡；taiwanoid A此前仅报道可抑制骨肉瘤细胞活性（抑制率>50%），其抗OSCC疗效和机制尚未充分阐明。本研究显示taiwanoid A影响MAPK、PI3K-AKT和Wnt通路：抑制ERK和P38磷酸化可影响癌细胞运动、侵袭和转移；抑制PI3K和AKT磷酸化可抑制肿瘤生长；降低β-catenin Ser552磷酸化与AKT介导的β-catenin激活和核转位减少一致。靶点预测、分子对接、DARTS和CETSA共同支持taiwanoid A与EGFR的细胞靶点结合，p-EGFR（Tyr1068）浓度依赖性降低提供蛋白水平支持，但p-EGFR降低也可能反映受体周转、转运或上游调控改变，而非明确直接抑制EGFR催化激酶结构域；EGFR敲低实验支持EGFR依赖的信号通路。讨论同时列出局限：体内实验每组仅5只小鼠且仅用单一CAL27皮下异种移植模型；机制和功能实验主要在单一OSCC细胞系CAL27中进行，未纳入非恶性口腔上皮模型；短时划痕实验不能完全排除增殖或活力变化的影响；Matrigel管状结构形成仅反映体外血管生成拟态相关网络表型，未评估体内CD31/PAS双染和特异性血管生成拟态分子标志；taiwanoid A为经多步色谱纯化的稀缺天然二萜，纯化量有限优先用于体内实验，限制额外细胞系验证；未全面评估系统毒性和药代动力学暴露，未检测血清生化指标和主要器官组织病理；未进行纯化EGFR激酶实验、SPR或ITC等直接生物物理结合实验及EGFR再表达挽救实验，未评估核β-catenin定位或TCF/LEF报告基因活性，因此支持EGFR相关靶点结合和信号参与，但未确立直接EGFR催化激酶抑制或EGFR为唯一主要靶点，也未确立经典Wnt转录活性的明确抑制。结论译文：综上，本研究支持一种EGFR相关机制，即taiwanoid A调控下游MAPK/PI3K-AKT通路及β-catenin相关信号，从而抑制细胞迁移、侵袭、增殖、集落形成和肿瘤细胞管状结构形成，最终影响肿瘤生长和恶性进展。该研究揭示taiwanoid A在口腔癌治疗中的潜在应用，并为抗肿瘤药物开发提供新方向；通过深入研究其作用机制，可更好理解其对癌细胞的影响，为未来临床应用奠定理论基础。鉴于口腔癌发病率和死亡率不断上升、亟需新的治疗策略，这些发现支持在OSCC中进一步开展taiwanoid A的临床前评价。
